发酵液预处理和固液分离技术-食品生物技术

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：发酵液预处理的任务是分离发酵液和细胞，去除大部分杂质，破碎细胞释放胞内产物，对目标产物进行初步富集和分离。为了改善发酵液的过滤速率，通常在发酵液预处理过程中加入助滤剂。（二）发酵液固液分离技术固液分离是指将发酵液中的悬浮固体，如细胞菌体、细胞碎片以及蛋白质等沉淀物或它们的凝聚体分离除去，以得到清液和固态浓缩物。

（一）发酵液的预处理技术

1.发酵液预处理的目的

微生物发酵结束后的培养物中含有大量的菌体细胞或细胞碎片、残余的固体培养基以及代谢产物。发酵液预处理的任务是分离发酵液和细胞，去除大部分杂质，破碎细胞释放胞内产物，对目标产物进行初步富集和分离。对于胞内产物，预处理的主要目的是尽可能多地收集菌体细胞。对于胞外产物，发酵液预处理应该达到以下3个方面的目的：①改变发酵液中菌体细胞等固体粒子的性质，如改变其表面电荷的性质、增大颗粒直径、提高颗粒硬度等，加快固体颗粒的沉降速度；②尽可能使发酵产物转移到液相中，以利于产品收率的提高；③去除部分杂质，减轻后续工序的负荷，如促使某些可溶性胶体变成不溶性粒子、降低发酵液黏度等。

2.发酵液预处理方法

（1）降低黏度　根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速率与液体的黏度成反比，因此降低液体黏度可以提高过滤速率，通过加水稀释法、加热升温法和酶解法来降低发酵液的黏度。

（2）调整pH　pH能影响发酵液中某些成分的表面电荷性质和电离度，改变这些物质的溶解度等性质，适当调节pH可以改善其过滤特性。例如，大多数蛋白质的等电点都在酸性范围内（pH4.0～4.5），利用酸性试剂来调节发酵液pH使之达到等电点，可除去蛋白质等两性物质。

（3）凝聚和絮凝　凝聚法是指在某些电解质作用下，破坏细胞，菌体和蛋白质等胶体粒子的分散状态，使胶体粒子聚集的过程。常用的凝聚剂有：无机盐类，如Al2（SO4）3·18H2O（明矾）、AlCl3·6H2O、FeCl3、ZnSO4、MgCO3等；金属氧化物类，如Al（OH）3、Fe3O4、Ca（OH）2或石灰等。

絮凝是指使用絮凝剂在悬浮离子之间产生架桥作用而使胶粒形成粗大絮凝团的过程。常用的絮凝剂有：有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生物、聚苯乙烯类衍生物；无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁盐等；以及天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、海藻酸钠、明胶、骨胶、壳多糖、脱乙酰壳多糖等。

（4）加入反应剂　加入某些不影响目的产物的反应剂，利用反应剂和某些可溶性盐类反应生成不溶性沉淀，可以消除发酵液中某些杂质对过滤的影响，从而提高过滤效率。如环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸盐处理，生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余的磷酸根离子还能去除钙、镁离子，并且在发酵液中不会引入其他阳离子，以免影响环丝氨酸的离子交换吸附。正确选择反应剂和反应条件，能使过滤速率提高3～5倍。

（5）加入助滤剂　发酵液中的菌体细胞、凝固蛋白质等悬浮物往往颗粒细小且受压易变性，直接过滤容易导致滤布等过滤介质的滤孔堵塞，过滤困难。为了改善发酵液的过滤速率，通常在发酵液预处理过程中加入助滤剂。助滤剂是一类刚性的多孔颗粒，一方面它能在过滤介质表面形成保护，延缓过滤介质被细小悬浮颗粒堵塞的速率；另一方面，加入助滤剂后，发酵液中悬浮的胶体粒子被吸附在助滤剂的表面，过滤时滤饼的可压缩性降低，过滤阻力减小。常用的助滤剂有硅藻土、珍珠岩、石棉粉、白土等非金属矿物质，以及纤维素、淀粉等有机质。

（二）发酵液固液分离技术

固液分离是指将发酵液（或培养液）中的悬浮固体，如细胞菌体、细胞碎片以及蛋白质等沉淀物或它们的凝聚体分离除去，以得到清液和固态浓缩物。可采用过滤、离心分离、重力沉降和浮选等，其中过滤和离心分离为较为常用的方法。

1.过滤分离

利用多孔性介质（如滤布）截留固液悬浮物中的固体粒子，进行固液分离的方法称为过滤。依据过滤的原理不同，过滤操作可分为滤饼过滤和澄清过滤两种方式；按照料液流动方向的不同，分为封头过滤和错流过滤两种。

（1）滤饼过滤　以滤布为过滤介质，当悬浮液通过滤布时，固体颗粒被滤布截留并逐渐在滤布表面堆积形成滤饼，在滤饼达到一定厚度时即起到过滤作用，此时能获得澄清的滤液。悬浊液中的土体颗粒堆积形成的滤饼起着主要过滤作用。滤饼过滤中前期浑浊的滤液需要回流到悬浊液进行二次过滤，该种过滤方式适合于固体含量大于0.1g/100mL的悬浊液的过滤分离。

（2）澄清过滤　以硅藻土、珍珠岩、砂、活性炭等填充于过滤器内形成过滤层，也有用烧结陶瓷、烧结金属、黏合塑料等组成的成型颗粒滤层，当悬浊液通过过滤层时，固体颗粒被阻拦或吸附在滤层的颗粒上，使滤液澄清。在这种过滤方式中，过滤介质起主要过滤作用。澄清过滤适用于固体含量小于0.1g/100mL且颗粒直径在5～100μm的悬浊液的过滤分离。

（3）封头过滤　料液流动方向垂直于过滤介质表面，过滤时滤液垂直透过过滤介质的微孔，而固体颗粒在过滤介质表面逐渐堆积形成滤饼。在这种过滤方式中，随着过滤操作的进行滤饼厚度不断增加，过滤阻力不断增强，致使过滤速率下降，此时为了维持或提高过滤速率，必须同步提高过滤压力。封头过滤适合颗粒直径10μm以上的悬浮固体的过滤分离。(www.chuimin.cn)

（4）错流过滤　料液流动方向平行于过滤介质表面，过滤时滤液在过滤介质表面快速流动产生剪切作用，阻止固体颗粒在介质表面沉积从而维持较高过滤速率。理论上，流速越大，剪切力越大，越有利于维持高速过滤。其优点是能减缓过滤介质表面污染，实现恒压下高速过滤，缺点是切向流所产生的剪切力作用可使蛋白质等活性产物失活。通过采用反向脉清洗，即在错流过滤过程中，间歇地在过滤介质的背面施加一反向压力，以滤液冲掉沉积在膜面上的固体沉积物和空隙中的堵塞物。

在生物分离中，应用较广并有工业意义的过滤设备是板框压滤机和转鼓真空过滤机。在生物反应领域中，几乎所有的发酵液均存在或多或少的悬浮固体，常采用过滤操作。如谷氨酸发酵用糖液的脱色过滤处理和啤酒生产中麦汁的过滤澄清。过滤技术常用于生物制药行业中对组织、细胞匀浆和粗制提取液的澄清以及半成品乃至成品等液体的除菌。

2.离心分离

离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的分离过程。不同密度或不同大小及形状的物质在重力作用下的沉降速率不同，在形成密度梯度的液相体系中的平衡位置不同。离心分离过程就是以离心力加速不同物质沉降分离的过程。被分离物质之间必须存在或经人为处理产生密度或沉降速率差异才能以离心方法进行分离。在液相非均一系的分离过程中，利用离心力来达到液—液分离、液—固分离或液—液—固分离的方法统称为离心分离。

离心分离可分为离心沉降和离心过滤两种形式。①离心沉降：利用悬浮液密度不同的特性，在离心机无孔转鼓或管子中，液体被转鼓带动高速旋转，密度较大的物相向转鼓内壁沉降，密度较小的物相趋向旋转中心而使液—固或液—液分离的操作；②离心过滤：利用离心力并通过过滤介质，通过有空转鼓离心机中转鼓的带动作用，使得悬浮液高速旋转，液体和其中悬浮颗粒在离心力作用下快速甩向转鼓而使转鼓两侧产生压力差，在此压力差作用下，液体穿过滤布排出转鼓，而悬浮颗粒被滤布截留形成滤饼，从而实现液—固分离操作。

常用的离心分离设备是离心机。根据其离心力大小，可分为低速离心机、高速离心机和超离心机；按型式可分为管式、多室式、卧螺式和碟片式等；按作用原理不同可分为过滤式离心机和沉降式离心机两大类；按出渣方式可分为人工间歇出渣和自动出渣等方式。离心机在食品和发酵工业中的应用十分广泛，如酵母发酵醪的浓缩、啤酒和果酒的澄清、谷氨酸结晶的分离、各种发酵液的微生物分离以及抗生素、干扰素生产等都离不开各种类型离心设备的使用。与其他固液分离方法相比，离心分离具有分离速率快、分离效率高、液相澄清度很高等优点。缺点是离心分离设备存在投资费用高、能耗大，以及连续排料时固相干度不如过滤设备。

（三）微生物细胞的破碎

微生物代谢产物大多分泌到细胞外，如大多数小分子代谢物、细菌或真菌产生的胞外蛋白酶等，都称为胞外产物。但有些目标产物，如谷胱甘肽、虾青素、花生四烯酸等以及一些基因工程产物如胰岛素、干扰素、生长激素等，都存在于胞内，称为胞内产物。当待分离产物存在于胞内时，必须通过细胞破碎技术先破碎细胞，才能进行目标产物的分离与纯化。细胞破碎技术是指利用外力破坏细胞壁和细胞膜，使细胞内目标物释放出来的技术。

1.细胞壁结构与细胞破碎

微生物细胞壁的形状和强度取决于细胞壁的组成以及它们之间相互关联的程度。破碎细胞必须克服的主要阻力是连接细胞壁网状结构的共价键。在机械破碎中，细胞的大小、形状以及细胞壁的厚度和聚合物的交联程度是影响破碎难易程度的重要因素。在合理选用酶法和化学法破碎细胞时，非常有必要了解细胞壁的组成，其次是细胞壁的结构。各种微生物细胞壁的结构与组成见表6-5。

表6-5　各种微生物细胞壁的结构与组成

2.常用破碎方法

进行细胞破碎的目的是释放胞内目标产物，方法很多（见表6-6），按其是否使用外加压力可分为机械破碎法和非机械破碎法两大类（见表6-7）。

表6-6　细胞破碎方法分类

表6-7　机械破碎法与非机械破碎法的比较

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