生物发酵污染控制-食品生物技术

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：（二）生物发酵中的污染检查发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果作为依据进行判断，检查杂菌和噬菌体的方法要求准确、可靠、快速，这样才能避免染菌造成严重经济损失。发酵过程中污染检查的程序制度，也是控制污染的重要手段和保障。

自发酵技术应用纯种培养以来，许多发酵过程都要求纯种培养，即在培养期间除大量繁殖生产菌外，不允许其他任何微生物（统称为杂菌）存在。若在培养过程中（特别是种子扩大培养和发酵前）有少数杂菌存在，它便可在发酵系统内迅速繁殖，与生产菌争夺营养成分，因而干扰生产菌正常发酵，甚至酿成倒罐。因此在发酵操作上要求设备、培养基、空气、环境等均要严格消毒灭菌，整个发酵过程和体系中均需要控制非发酵使用微生物的污染。

杂菌是指发酵培养中侵入了有碍生产的其他微生物。染菌是发酵工业的大敌。当以细菌和放线菌为生产菌株时，有噬菌体侵染所造成的损失是十分严重的。轻者影响产量和产品质量；重者可能导致倒罐，甚至停产。对于杂菌和噬菌体，在发酵工业上必须树立以防为主，防重于治的观念。染菌对发酵产率、提取收得率、产品质量和“三废”治理等都有很大影响。然而，生产不同品种，污染不同种类和性质的杂菌，不同的污染时间，不同的污染途径、污染程度，不同培养基和培养条件，所产生的后果不同。

（一）染菌对发酵的影响

1.污染不同种类和性质微生物的影响

噬菌体感染力强、传播蔓延迅速且较难防治，污染噬菌体后可使发酵产量大幅度下降，严重甚至造成倒罐，断种和停产。有些杂菌会使生产菌自溶产生大量泡沫从而影响发酵过程的通气搅拌，还有些杂菌则会使发酵液变臭、发酸，pH下降，从而不耐酸的产品遭到破坏。由于芽孢耐热，不易杀死，因此往往污染一次芽孢杆菌后会反复染菌。

2.染菌时间对发酵的影响

种子培养阶段主要是生长繁殖菌体，生产菌体浓度低且培养基营养丰富，在此阶段染菌则会造成种子质量严重下降，危害极大，因此，应该严格控制种子染菌的发生，一旦发现种子染菌，就应灭菌后弃去并对种子罐和管道等进行检查和彻底灭菌。生产菌在发酵前期处于生长繁殖阶段，代谢产物较少，染菌后的杂菌迅速繁殖与生产菌争夺营养成分，因此该阶段发现染菌可灭菌并补加营养后重新接种；发酵中期染菌危害性大且较难处理，染菌将严重干扰生产菌的繁殖和产物的生成，因此生产过程中应做到早预防、早发现和早处理，处理方法应根据各种发酵的特点和具体情况来决定；发酵后期发酵液内已经积累大量的产物，特别是抗生素，对杂菌有一定的抑制或杀灭能力，因此，此阶段如果染菌不多对生产影响不大则可继续发酵，如果染菌严重且破坏性较大，可提前放罐提取产物。

3.染菌途径对发酵的影响

种子带菌可使发酵染菌具有延续性，将会使后继发酵中出现杂菌，因此需要严格控制；空气带菌也使发酵染菌具有延续性，导致染菌范围扩大至所有发酵罐，可通过加强空气无菌检测进行控制；由于培养基或设备灭菌不彻底导致的染菌一般为孤立事件，并不具有延续性；而设备渗漏造成的染菌危害性较大，常会造成严重染菌和发酵失败。

（二）生物发酵中的污染检查

发酵过程是否染菌应以无菌试验的结果作为依据进行判断，检查杂菌和噬菌体的方法要求准确、可靠、快速，这样才能避免染菌造成严重经济损失。发酵过程中污染检查的程序制度，也是控制污染的重要手段和保障。检查需要在从菌种的扩大培养，到发酵的过程全程进行，总的原则是所有过程中的每一步操作前后均需要污染检查；同时在发酵培养间隔一定时间后也需要进行污染的检查。目前生产上对于杂菌的检查方法主要包括以下几种：

1.显微镜检查

通常用革兰氏染色法对样品进行染色，并在显微镜下观察微生物的形态特征，根据生产菌和杂菌的特征进行区别以判断是否染菌，必要时可进行芽孢染色和鞭毛染色。镜检法是检查杂菌最简单、直接和最常用的方法。

2.平板划线培养或斜面培养检查法

先将制备好的平板置于37℃培养箱保温24h，检查无菌后将待测样品在无菌平板上划线，分别于37℃和27℃进行培养，一般在8h后即可观察，如连续发现3次有异常菌落的出现即可判断为染菌。

3.肉汤培养检查

将待检样品接入经灭菌并检查无菌的葡萄糖酚红肉汤培养基，于37℃和27℃进行培养24h，观察颜色变化，如连续3次由红色变为黄色或产生浑浊，则可定为染菌，其后取样镜检。此法适用于检查培养基和无菌空气是否带菌，用于噬菌体检查时使用生产菌作为指示菌。

4.发酵过程的异常现象观察法

对以细菌为生产菌的发酵过程，发酵感染噬菌体后往往出现一些异常现象，如菌体停止生长，发酵液光密度（OD值）不再上升或回降；糖耗缓慢或停止；产物合成减少或停止；镜检时菌体明显减少；有时pH逐渐上升或发现大量泡沫等。

（三）生物发酵过程中污染的原因分析

引起染菌原因很复杂，污染后发酵罐内的反应也多种多样，发现污染时还是要从多方面查找原因，采取相应措施予以解决。据国内外多年的发酵生产经验分析，污染原因或途径主要有以下几方面：

1.种子污染

种子染菌包括种子本身带有杂菌和种子培养过程中污染杂菌两方面。常由于无菌室设计不合理，消毒工作不彻底，操作不妥及管理不善等造成，加强种子管理，严格执行无菌操作，种子本身带菌可以克服。

2.灭菌不彻底

培养基及发酵罐、补料系统、消泡剂、接种管道等灭菌不彻底，都可能导致发酵污染。

3.空气带菌

过滤器失效或设计不合理往往引起染菌，目前，国内外空气除菌技术虽已有较大改善，但仍然没有使染菌率降低到理想的程度，这是因为空气除菌系统较为复杂，环节多，稍有不慎便会导致空气除菌失败。

4.设备渗漏(www.chuimin.cn)

设备渗漏包括夹套或列管穿孔，阀门、搅拌轴封渗漏及设备安装不合理，死角太多等，加强设备本身及附属零部件的维护检修及严密度检查，对防止染菌极其重要。

5.技术管理不善

这也是造成染菌的重要原因之一。技术管理不善的原因第一是生产设备维护检修验收制度不严；第二是违章操作；第三是操作不熟练。因此，技术管理要对发酵每个环节进行严格控制，不能因有侥幸心理而放松管理。

（四）生物发酵过程染菌的防治

1.防止种子带菌

在每次接种后应留取少量的种子悬浮液进行平板和肉汤培养，以说明是否有种子带菌。种子制备过程中，对沙土管及摇瓶要严格控制。制备沙土时，要多次间歇灭菌，确保无菌；子瓶和母瓶的移种和培养时严格要求无菌操作；无菌室和摇床间要保持清洁。

2.防止设备渗漏

发酵设备及附件由于化学腐蚀，电化学腐蚀，物料与设备摩擦造成机械磨损，以及加工制作不良等原因会导致设备及附件渗漏。设备一旦渗漏，就会造成染菌，如冷却盘管、夹套穿孔渗漏，有菌的冷却水便会通过漏孔而进入发酵罐中导致染菌。阀门渗漏也会使带菌的空气或水进入发酵罐而造成染菌。

设备的渗漏如果肉眼容易看见，则容易治理；但是有的微小渗漏，肉眼看不见，必须通过一定的试漏方法才能发现。试漏方法可采用水压试漏法。即被测设备的出口处装上压力表，将水压入设备，待设备中压力上升至要求压力时，关闭进出水，看压力是否下降，压力下降则有渗漏。但有些渗漏很小，看不出何处渗漏水，可以将稀碱溶液压入设备，然后用蘸有酚酞的纱布擦拭，酚酞变红处即为渗漏处。

3.防止培养基灭菌不彻底

培养基灭菌前含有大量杂菌，灭菌时如果蒸汽压力不足，达不到要求的灭菌温度，灭菌时产生大量泡沫或发酵罐中有污垢堆积等均会造成灭菌培养基不彻底。

空罐预消毒或实罐灭菌时，均应充分排净发酵罐内的冷空气，这样在通入高温高压蒸汽时，发酵罐内能够达到规定的灭菌压力，保证达到要求的灭菌温度。同时，灭菌结束，开始冷却时，因蒸汽冷凝而使罐压突然下降甚至会形成真空，此时必须将无菌空气通入罐内保持一定压力，以免外界空气进入而引起杂菌污染。

灭菌时还会因设备安装或污垢堆积造成一些死角，这些死角蒸汽不能有效到达，常会窝藏湿热芽孢杆菌，因此，设备安装时，不能造成死角，发酵设备要经常清洗，铲除污垢。

4.防止空气引起的染菌

无菌空气是引起发酵染菌的重要原因，要控制无菌空气带菌，就要从空气的净化流程和设备的选择，过滤介质的选材和装填，过滤器灭菌和管理方法的完善等方面来强化空气净化系统。压缩空气需要选择良好的气源。过滤器用蒸汽灭菌时，若被蒸汽冷凝水润湿，就会降低或丧失过滤效能，所以灭菌完毕后应立即缓慢通入压缩空气，将水分吹干。超细纤维纸作过滤介质的过滤器，灭菌时必须将管道中的冷凝水放干净，以免介质受潮失效。在实际生产中，无菌空气管道大多与其他物料管道相连接，因此，必须装上止回阀，防止其他物料逆流窜入空气管道污染过滤器，导致过滤介质失效。

（五）噬菌体的防治

1.噬菌体对发酵的影响

噬菌体的感染力非常强，极易感染用于发酵的细菌和放线菌。噬菌体感染的传播蔓延速度非常快且很难防治，给发酵生产带来巨大的威胁。发酵过程受噬菌体侵染，一般会发生溶菌，随之出现发酵迟缓或停止，而且噬菌体感染后往往会反复感染，使生产无法进行，甚至倒罐。

2.产生噬菌体污染的原因

环境污染噬菌体是造成噬菌体感染的主要根源。通常在工厂投产初期不会发觉噬菌体的危害，经过几年之后，主要由于生产和试验过程中不断将许多活菌体排放到周围环境中，自然界中的噬菌体就在活菌体中大量生长，为自然界中噬菌体快速增殖提供了良好条件。这些噬菌体随着风沙尘土、空气流动等到处传播，可能潜入生产的各个环节，尤其是通过空气系统进入种子室、种子罐和发酵罐。

3.噬菌体污染的检测

要判断发酵过程中有无感染噬菌体，最根本的方法是噬菌斑检验。在无菌培养皿上倒入培养生产菌的灭菌培养基作下层。同样地，培养基中加入20%～30%培养好的种子液，再加入待测发酵液，摇匀后，铺上层。培养12～20h后观察培养皿上是否出现噬菌斑。也可以在上层培养基中只加种子液，而将待测发酵液直接点种在上层培养基表面，培养后观察有无透明圈出现。

4.噬菌体的防治措施

噬菌体的防治是一项系统工程，涉及发酵生产管理的各方面。从菌种保藏、种子培养、培养基灭菌、无菌空气制备、生产设备管理、检测分析到环境卫生等各个环节，均必须规范操作，严格把关，才能有效防止噬菌体的危害。主要做好三方面：①定期检查，及时消灭噬菌体；②加强管理，严格执行操作规程；③选育抗噬菌体菌株和轮换使用生产菌株。

5.噬菌体污染后的应急措施

发现了噬菌体污染时，首先必须取样检查，并根据各种异常现象做出正确的判断，尽快采取相应的挽救措施：①加入少量药物，以阻止噬菌体繁殖，如可加入少量草酸和柠檬酸等螯合剂阻止噬菌体吸附；加入一些抗生素抑制噬菌体蛋白质的合成及增殖，该法仅适用于耐药的生产菌株，由于成本较高，无法在较大的发酵罐中使用。②发酵过程中污染噬菌体时，可补入适量的新鲜培养基或生长因子，促进生产菌生长，加快发酵速度，使发酵得以顺利进行。③大量补接种子液或重新接种抗性菌种培养液，以便继续发酵至终点，防止倒罐，尽可能减少损失。在补种之前也可对已感染噬菌体的发酵液进行低温灭菌处理。

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