菌种保藏：选择正确方法进行保藏，持续保存多种微生物

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：菌种发生退化的原因主要有基因突变、连续传代以及不当的培养和保藏条件。沙土管保藏法一般较适合能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌保藏，但不能用于保藏营养细胞。冷冻干燥保藏法因为能满足低温、干燥和缺氧三项条件，菌种可保存10年以上，该方法需要一定的设备，有严格的操作要求，还需要保持剂，因而保藏成本相对较高。该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体都能用此法获得有效保藏。

菌种是发酵工业生产的根本，因此，菌种保藏是一项重要的工业微生物学基础工作，优良的菌种来之不易，所以在科研和生产中应该设法减少菌种的衰退和死亡，菌种保藏的目的就是在保证菌种不死亡的同时，尽可能保持其原有的优良发酵性状，不被杂菌所污染，并降低菌种衰退的速率。但保藏不可能保证绝对不变异，只是尽可能降低菌种的变异速度。

（一）菌种的退化和防止

菌种退化，主要指生产菌种或选育过程中筛选出来的较优良菌株，由于进行接种传代或保藏之后，群体中某些生理特征和形态特征逐渐减退或完全丧失。集中表现在目的代谢物合成能力降低，产量下降，有的则是发酵力和糖化力降低。菌种发生退化的原因主要有基因突变、连续传代以及不当的培养和保藏条件。

遗传是相对的，变异是绝对的。因此，要求一个菌种永远不衰退并不可能，但可以做到积极采取措施，延缓退化。防止菌种退化的方法主要有以下几种：①尽量减少传代；②经常对菌种进行纯化；③创造良好的培养条件；④用单核细胞移植传代；⑤采用有效的菌种保藏方法。

（二）退化菌种的复壮

在发生了退化的菌种中一般仍然有少量尚未衰退的个体存在。因此，可以通过人工选择法从中分离筛选出那些具有优良性状的个体，使菌种获得纯化，即为复壮。退化菌种的复壮可通过纯种分离和性能测定等方法实现，主要措施包括从退化菌种的群体中找出少数尚未退化的个体，以达到恢复菌种的原有典型性状。也可以在菌种的生产性能尚未退化前就常有意识地进行纯种分离和生产性能的测定工作，以达到菌种的生产性能逐步提高。

具体的菌种的复壮包括采用平板划线分离法、稀释平板法或涂布法，将仍保持原有典型优良性状的单细胞分离出来，经扩大培养恢复原菌株的典型优良性状，若能进行性能测定则更好。还可用显微镜操纵器将生长良好的单细胞或单孢子分离出来，经培养恢复原菌株性状；寄生型微生物的退化菌株可接种到相应寄主体内以提高菌株的活力；此外，还可用高剂量的紫外线辐射和低剂量的亚硝基胍联合处理对退化菌株进行复壮。

（三）菌种保藏的原理和方法

菌种保藏是指在广泛收集实验室和生产菌种的基础上，将它们妥善保藏，使之达到不死、不衰、不污染以便于研究、交换和使用的目的。菌种保藏的具体方法很多，原理却大同小异。首先挑选典型菌种的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如分生孢子、芽孢等）；其次，创造一个适合其长期休眠的环境条件，如干燥、低温、缺氧、避光、缺乏营养以及添加保护剂或酸度调节剂等。几种常用的菌种保藏方法如下：

1.斜面传代保藏法

斜面低温保藏法的原理是低温。方法是将菌种接种在不同成分的斜面培养基上，待菌种生长完全后，便置于4℃左右冰箱中保藏，每隔一定时间进行移植培养，再将新斜面继续保藏。适用范围是各类微生物。保藏特点是操作简单，不需特殊设备，但该方法从保藏原理方面只满足了低温一项要求，因而代谢水平仍然很高，是一种短期的、过渡性的临时保藏方法。优点是简单快捷、操作方便，缺点是易变异、易污染，易使菌株发生自发突变、易引起菌种的退化甚至死亡。

2.矿油封藏法

矿油封藏法又称液体石蜡保藏法，原理是低温、缺氧、缺营养。液体石蜡保藏法其实是斜面保藏的一种方式，该法由于在斜面中加入了液体石蜡，保存期间可以防止培养基水分蒸发并隔绝氧气，因此可以进一步降低代谢活动，推迟细胞退化。此法适用于不能利用石蜡作碳源的、产孢子的细菌、霉菌、放线菌等微生物。特点是简单易行，但工作量大，费人力。(www.chuimin.cn)

液体石蜡保藏法能满足低温和缺氧两项条件，通常可保存较长时间。霉菌、放线菌、有芽孢细菌可保藏2年左右，酵母菌可保藏1～2年，一般无芽孢细菌也可保藏1年左右。

3.沙土管保藏法

沙土管保藏法是国内常采用的一种菌种保藏方法，是利用微生物芽孢、孢子与干燥无菌细沙土混合进行菌种低温保藏的方法。沙土管保藏法一般较适合能产生芽孢的细菌及形成孢子的霉菌和放线菌保藏，但不能用于保藏营养细胞。保藏特点是干燥、低温、隔氧、无营养物，菌种可保存2年左右。

4.冷冻干燥保藏法

冷冻干燥保藏法是较理想的保藏方法。保藏原理是将菌体在-15℃下快速冷冻以保持细胞完整，再使水分升华，微生物暂时停止生长代谢，减少发生变异的概率。该方法的基本操作过程是先将微生物制成悬浮液，再与保护剂混合，然后放在特制的安瓿管，用低温酒精或干冰使其迅速冻结，在低温下用真空泵抽干，最后将安瓿管真空熔封，并低温保藏。保护剂一般采用脱脂牛奶或血清等。

冷冻干燥保藏法因为能满足低温、干燥和缺氧三项条件，菌种可保存10年以上，该方法需要一定的设备，有严格的操作要求，还需要保持剂，因而保藏成本相对较高。但由于该方法保藏效果较好，且适用于各类微生物，是目前最有效的菌种保藏方法之一，因而国内外都已普遍采用。

5.液氮超低温保藏法

菌种以甘油、二甲亚砜等作为保护剂，在液氮超低温（-196℃）下保藏的方法。因为一般微生物在-130℃以下新陈代谢活动即完全停止。因此，它比其他保藏方法都要优越，是防止菌种退化最有效的方法。该法适用于各种微生物菌种的保藏，甚至连藻类、原生动物、支原体都能用此法获得有效保藏。

液氮超低温保藏技术已经被公认为当前最有效的菌种长期保藏技术之一，在国外已普遍采用。尽管这一方法起步较晚，但其适用范围最广，尤其适用于一些不产孢子的菌丝体，因为用其他方法保藏这类微生物效果都不理想，用此方法保藏则时间较长。但这一方法对设备、材料及操作方法要求都较高，保藏期间维持费用也较高，因而使这一方法的应用受到一定限制。

6.工程菌的保藏

目前常用的工程菌宿主主要是大肠杆菌和毕赤酵母，它们构建成基因工程菌之后也需要妥善的保藏，否则易造成质粒丢失、非同源重组或其他退化现象。常用的保藏方法是将甘油和菌体或菌悬液摇匀后置于-80℃冰箱保藏，甘油的终浓度在10%～30%。也可在斜面上进行保藏，但保存时一定要在培养基中加入一定浓度的抗生素或其他的选择压力，以保持菌种的稳定性。该法较为简便，保藏期较长，但是需要有超低温冰箱。

无论采取上述何种菌种保藏方法，均需对保藏菌种进行质量控制，保藏样品制备前，应反复核对，监测生理生化指标，与亲本特征进行比较；保藏样品制备后，仍要按3%进行抽样检查，一旦有误则该批样品全部作废；同时还应注意菌种保藏的连续性；菌种保藏期限到之后应该进行活化检验，从中筛选高产菌种再进行保存。总之，菌种保藏是一项长期的工作。

菌种保藏：选择正确方法进行保藏，持续保存多种微生物

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