食品生物技术：微生物菌种鉴定技术

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：不论欲鉴定的菌种对象属哪一类，鉴定工作基本类似。每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构，不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表其亲缘关系的远近。因此，测定每种微生物的DNA若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要的指标。可以通过DNA的碱基组成、核酸的分子杂交、遗传重组特性分析、rRNA序列分析等技术鉴定微生物菌种。可将筛选分离到的菌种送到这些机构直接鉴定。

菌种鉴定工作是筛选获得目的菌纯培养物后首先要进行的基础性工作。不论欲鉴定的菌种对象属哪一类，鉴定工作基本类似。经复筛得到的野生型菌株一般都要进行菌种鉴定，为后续研究奠定基础。菌株鉴定分为3个步骤：①获得该微生物的纯种分离物；②测定一系列必要的鉴定指标；③根据权威鉴定手册（如《伯杰氏细菌鉴定手册》）进行菌种鉴定。常用的鉴定方法或指标如形态结构、生理生化特征、血清学反应和遗传特征等。

（一）经典的分类鉴定方法

所谓经典分类鉴定方法，是相对现代分类鉴定方法而言，通常指长期以来在鉴定中普遍采用的如形态、生理、生化、生态、生活史和血清学反应等指标。常用的鉴定指标有以下几种：

1.形态学特征

形态学特征包括菌落特征、细胞形态、细胞大小、细胞排列、特殊的细胞结构、染色反应等。

2.生理生化特征

生理生化特征包括营养类型、对氮源的利用能力、对碳源的利用能力、对生长因子的需要、需氧性；对温度、pH渗透压的适应性；对抗生素及抑菌剂的敏感性；代谢产物及其与宿主的关系等。

3.血清学试验与噬菌体分型

血清学试验与噬菌体分型可以在生物体外进行不同微生物之间抗原与抗体反应试验——血清学试验来进行微生物的分类和鉴定。使用的方法除凝集反应外，还有沉淀反应（如凝胶扩散、免疫电泳）、补体结合、直接或间接的免疫荧光抗体技术、酶联免疫以及免疫组织化学等。

4.氨基酸顺序和蛋白质分析

氨基酸顺序和蛋白质分析可通过对比某些同源蛋白质氨基酸序列来分析不同生物系统发育的关系，序列相似性越高，其亲缘关系愈近。由此，可根据蛋白质的氨基酸序列资料构建系统发育树并据此进行系统分类。

（二）现代分类鉴定方法

近年来，随着分子生物学的发展和各项新技术的广泛应用，促使微生物分类鉴定工作有了飞跃的发展。对微生物鉴定工作来说，已从经典的表型特征的鉴定深入到现代的遗传学特性的鉴定、细胞化学组分的精确分析以及利用计算机进行数值分类研究等新的层次上。

1.微生物遗传型的鉴定

DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微生物均有其自己特有的、稳定的DNA成分和结构，不同微生物间DNA成分和结构的差异程度代表其亲缘关系的远近。因此，测定每种微生物的DNA若干重要数据，是微生物鉴定中极其重要的指标。可以通过DNA的碱基组成、核酸的分子杂交、遗传重组特性分析、rRNA序列分析等技术鉴定微生物菌种。

2.细胞化学成分特征分类法(www.chuimin.cn)

利用微生物之间除上述核酸成分外的其他化学成分的差异，可对微生物进行化学鉴定。常用于细菌分类的细胞成分分析有以下几种：①细胞壁的化学组分分析；②全细胞水解液的糖型；③脂肪酸组成及磷脂成分分析；④醌类及多胺类的分析；⑤可溶性蛋白的质谱分析。

细胞化学成分的分析方法有很多，比较常用的是红外光谱分析法。一般认为，每种物质的化学结构都有特定的红外吸收光谱，若两个样品的吸收光谱完全相同，可初步认为它们是同一种物质。因此，可用红外光谱技术测定微生物细胞的化学成分来进行微生物的分类。实验证明，这种技术适于“属”的分类，而不适于同一属内不同种或菌株之间的区分。该方法具有简单快速、样品用量少等优点。

3.数值分类法

数值分类法（numerical taxonomy）亦称计量分类法（taxonometrics），是在M.Adanson（1727—1806，法国植物学家）发表的分类原理基础上发展起来的。目前这种方法借助计算机技术而得到进一步发展。在工作开始时，必须先准备一批待研究菌株和有关典型菌种的菌株为运筹分类单位（OTU, operational taxonomic units）。其中，数值分类中的相似系数Ssm或SJ是以观察到的菌株间的共同特征的相似性为基础，因此要用50个以上甚至几百个特征进行比较，且所用特征越多，其结果也越精确。在比较不同菌株时，均要采用相同的可比特征，包括形态、生理、生化、遗传、生态和免疫等特征。

（三）权威鉴定机构鉴定菌种

国内外许多菌种鉴定机构和菌种保藏机构都提供菌种鉴定服务。可将筛选分离到的菌种送到这些机构直接鉴定。不仅可以节省大量时间，而且能得到较准确的结果。国内外权威的菌种保藏机构如下：

①中国微生物菌种保藏管理委员会（China Committee of Culture Collection for Microorganisms, CCCCM）。

②中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection, CICC）。

③中国典型培养物保藏中心（Chinese Center for Type Culture Collection, CCTCC）。

④中国科学院典型培养物保藏委员会（the Committee on Type Culture Collection of Chinese Academy of Sciences, CTCCCAS）。

⑤美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。

⑥英国国家典型培养物保藏中心（the United Kingdom National Culture Collection, UKNCC）。

⑦德国科赫研究所菌种保藏中心（Robert Koch Institute, RKI）。

⑧法国巴斯德研究所菌种保藏中心（Collection de L’Institute Pasteur, CIP）。