酶工程技术与食品添加剂在《食品生物技术》中的应用

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：但与原有的发酵法生产L-苯丙氨酸相比，酶法合成及其纯化具有工艺步骤少、生产能力较强和投资强度较低等优点，因此将成为最有效的L-苯丙氨酸合成途径。例如应用于某些食品或添加剂，具有增强稳定性，防止氧化和消除异味等功能。目前所研究的一些微生物原果胶酶依其作用机制可分为以下两类。B型原果胶酶作用于原果胶分子中“发区”中的不同部位，这类酶对底物的作用专一性较强。

（一）高甜度甜味剂

1.阿斯巴甜

阿斯巴甜的化学组成为L-天冬氨酰和L-苯丙氨酰甲酯，是由天冬氨酸和苯丙氨酸形成的二肽化合物。阿斯巴甜的甜度是蔗糖的180～200倍，口感清爽，甜味特征优良，但对热不稳定，不适于在需要高温加热的食品中应用。

生产阿斯巴甜的关键在于苯丙氨酸和天冬氨酸的生产。这两种原料可以通过发酵的方法生产，也可以采用酶法合成。但与原有的发酵法生产L-苯丙氨酸相比，酶法合成及其纯化具有工艺步骤少、生产能力较强和投资强度较低等优点，因此将成为最有效的L-苯丙氨酸合成途径。

2.三氯蔗糖

三氯蔗糖又称4，1＇，6-三氯半乳蔗糖，甜味特征近似于蔗糖，甜度是蔗糖的400～800倍，产热量极低，对光、热、pH均很稳定，不参与人体代谢，安全性较高，是一种很有发展前途的高度甜味剂。生产三氯蔗糖有两条路线。① 葡萄糖—蔗糖路线。首先利用芽孢杆菌属的菌株在30℃下发酵葡萄糖，生成葡萄糖-6-乙酸，然后由枯草杆菌产生的β-果糖基转移酶作用于葡萄糖-6-乙酸与蔗糖的混合物生成蔗糖-6-乙酸，蔗糖-6-乙酸与由五氯化磷和DMF制成的Vilsmeier试剂反应，即可得到4，1＇，6＇-三氯-4，1＇，6＇-三脱氧半乳糖蔗糖五乙酸。该五乙酸脱去乙酸基后，即得产物三氯蔗糖。②棉子糖路线。棉子糖广泛存在于甜菜和棉子等许多植物中，它也可以由α-半乳糖苷酶催化半乳糖和蔗糖的饱和溶液合成。棉子糖在氧化三苯膦的存在下，用亚硫酰氯氯化生成4，1＇，6＇，6＇-四氯-4，1＇，6＇，6"-四脱氧半乳糖棉子糖庚乙酸。该庚乙酸经脱乙酸作用后，即可生成4，1＇，6＇，6"-四氯-4，1＇，6＇，6"-四脱氧半乳糖棉子糖（TCR），TCR在30℃下，通过α-半乳糖苷酶水解生成三氯蔗糖。

（二）防腐保鲜剂

5′-鸟苷酸（5′-GMP）和5′-肌苷酸（5′-IMP）与味精按一定比例复配后可得超鲜味精，也称为强力味精，其鲜味、风味及生产成本均优于味精。

5′-核苷酸可通过酶法水解酵母中RNA制取，酵母细胞RNA含量很高，在其生长的对数期初期，采用热碱溶液提取RNA，再通将RNA沉淀和干燥。RNA在氢氧化钾溶液中，在130℃下加热3～4h，进行化学水解，即可以产生核苷酸，核苷酸还可以再通过5′酶或外切核酸酶的酶解获得。再经过从腺苷到鸟苷的脱氨基作用，使核苷酸磷酸生成5′-核酸-IMP和5′-GMP。

（三）稳定剂

环糊精是指由6～9个D-吡喃葡萄糖单元通过α-1，4糖苷键连接形成的“锥筒”状分子化合物，相应于D-吡喃葡萄糖的分子数，分别称为α-、β-、γ-和δ-环糊精，具有腔内亲油腔外亲水的独特结构，这一结构使其在医药、食品、化妆品等领域有重要应用价值。例如应用于某些食品或添加剂，具有增强稳定性，防止氧化和消除异味等功能。

（四）新型酶制剂及其应用

1.微生物原果胶酶的作用机制及其应用

果胶是一种杂多糖类高分子化合物，D-半乳糖醛酸（或部分甲酯化的D-半乳糖醛酸）通过α-1，4-糖苷键连成主链，在主链中常间或地插入一些α-L-吡喃鼠李糖残基、阿拉伯聚糖、半乳聚糖、阿拉伯半乳聚糖等形成侧链，将果胶分子与蛋白质、半纤维素以及纤维素连在一起，形成不溶性的原果胶。一般认为，在植物细胞壁中的原果胶是由同型半乳糖醛酸区（光滑区）以及带有中性糖侧链的鼠李聚糖半乳糖醛酸骨架（发区）组成，通过原果胶适当地降解可生成果胶与果胶酸。(www.chuimin.cn)

目前所研究的一些微生物原果胶酶依其作用机制可分为以下两类。

（1）A型原果胶酶　主要作用于原果胶分子中的“光滑区”。迄今发现了两类A型原果胶酶：一种为A1型原果胶酶，是一类内多聚半乳糖醛酸酶，能水解多聚半乳糖醛酸，对各种来源的原果胶分子均有作用。现已从酵母以及酵母状真菌：脆壁克鲁维酵母（Kluyvermyces fragilis）IFO0288，里氏半乳糖霉（Galactomyces reessii）L，帚状丝孢酵母（Trichosporon penicillatum）SNO3发酵液中结晶分离出，依次称为PPase-F, PPase-L和PPase-S。另外，在一些真菌如：泡盛酵母（Aspergillus awamori）的发酵液中也分离纯化到这种酶。另一种是A2型原果胶酶，Sakamoto等从枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）IFO 3134的发酵液中分离到两种A2型原果胶酶（PPase-N, PPase-R），PPase-N能通过反式消去反应断开聚半乳糖醛酸链，而PPase-R对聚甲酯化半乳糖醛酸表现出很强的活性。

（2）B型原果胶酶　作用于原果胶分子中“发区”中的不同部位，这类酶对底物的作用专一性较强。Sakai等在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilus发酵液中发现了原果胶酶（PPase-C），能断开阿拉伯半乳聚糖中α-1，5-L-阿拉伯呋喃糖苷与阿拉伯聚糖间的键，切断果胶与细胞壁间的连接，释放果胶。PPase-C对甜菜根，苹果皮中的原果胶有很强的作用活性。此外，从血红栓菌（Trameetes sanguinea）纯化到一种原果胶酶（PPase-T），能断开原果胶分子中半乳糖吡喃酰（galactopyranosyl）与鼠李糖吡喃酰“（rhamnopyranosyl）的连结。PPase-T对Hassaku柑橘皮以及胡萝卜中的原果胶有很强的作用活性，但当它作用于甜菜根以及苹果皮中的原果胶时，活性不高。

原果胶酶，尤其是帚状丝孢酵母（T.penicillatum）、泡盛酵母（A.awamori）以及枯草芽孢杆菌（B.subtilis）中的原果胶酶，能作用于植物组织产生松散的单细胞。酶处理的蔬菜组织所获得的单细胞，细胞完整，各种营养成分保存完好，表面及内部的张力较小而易与牛奶、酸奶、冰淇淋、汤等混合，且易被胃蛋白酶以及胰凝乳蛋白酶消化，适宜用作老人、婴儿以及病人的食品；细胞规格统一能赋予食品光滑的质地。

此外，原果胶酶还可以用于植物原生质体的制备，Mitsui等利用原果胶酶成功地制成了多种单子叶植物的叶肉原生质体。

2.转谷氨酰胺酶的功能特性及其应用

转谷氨酰胺酶可通过催化转酰基作用，使蛋白质或多肽之间发生交联反应。该酶为非钙离子依赖型酶，功能与动物来源的转谷氨酰胺酶很相似。转酰基反应的酰基供体为蛋白质或多肽链上氨酰胺残基的γ-羟基酰胺基，受体可以为蛋白质肽链上赖氨酸残基的ε-氨基、游离氨基酸的ε-氨基和初级氨或水。转谷氨酰胺酶所催化的反应既可以发生在分子间，也可以发生在分子内，决定分子间交联反应程度的因素主要为蛋白质本身的构象以及转谷氨酰胺酶的类型。

转谷氨酰胺酶的功能特性：①成胶特性：转谷氨酰胺酶具有成胶特性，可使未加热状态的各种食品蛋白质成胶，赋予不能成胶的蛋白质（如乳蛋白）成胶性，提高成胶的黏弹性，形成耐热性、耐酸性及耐水性等稳定性高的胶体；②改善乳化性：转谷氨酰胺酶可以改善蛋白质的乳化性质。例如检测单质β-酪蛋白和β-酪蛋白聚合物混合液的稳定性，发现随着混合液中聚合物比例的增大，该混合液的乳化稳定性增加；③提高发泡性能：WPI大豆11S球蛋白混合物的发泡稳定性较低，经过转氨酰胺酶处理过的WPI大豆11S球蛋白具有良好的稳定性。此外由于交联作用而使蛋白质流动性提高，赖氨酸残基上氨基电荷的去除也有利于增加泡沫的稳定性；④增强蛋白质溶液的黏稠性：蛋白质经聚合分子量增加后，其溶液的黏度通常也会增强，因此经过转谷氨酰胺酶处理过的蛋白质溶液往往具有较高的黏度；⑤提高凝胶的持水性：转谷氨酰胺酶催化形成的Glur-Lys键可提高凝胶的持水性能，使浓度为2%的蛋白质溶液也可以胶体化。这主要是因为所形成的交联键使蛋白质形成复杂的、严密的空间网络结构，对水分的束缚包容能力增强；⑥提高蛋白质的热稳定性：加热处理容易使蛋白质变性，并降低其功能特性。但是通过转谷氨酰胺酶发生交联所产生的Glur-Lys共价结合键，热稳定性很高，因此增强了蛋白质网络强度和凝胶断裂强度。

转谷氨酰胺酶除在肉制品和乳制品中有重要应用，在其他产品中也发挥重要作用。如在牛奶中的酪蛋白和乳清成分都有过敏原活性，通过转谷氨酰胺酶可以选择性地修饰抗原决定簇中的谷氨酰胺基，改变抗原决定簇的结构，阻止其与抗体的结合，减少抗原性。在保健食品中转谷氨酰胺酶交联蛋白质可作为脂肪的取代物等。

3.α-乙酰乳酸脱羧酶的作用原理及其应用

α-乙酰乳酸脱羧酶（α-acetolactate decarboxylase，简称ALDC, EC4.1.1.5）可以将α-乙酰乳酸直接脱羧转化成乙偶姻（acetoin），而不经形成双乙酰的步骤。双乙酰（diacetyl）主要是啤酒酵母代谢的产物，由α-乙酰乳酸（α-acetolactate）经非酶氧化脱羧产生。双乙酰对酒的口味有不良的影响，酵母的双乙酰还原酶能够将其还原成乙偶姻，再由乙偶姻还原酶还原为2，3-丁二醇。乙偶姻和2，3-丁二醇几乎不影响啤酒风味。因此，把双乙酰含量降到阈值以下是啤酒熟化期的主要目的。

α-乙酰乳酸的非酶氧化脱羧比双乙酰被还原的速度慢得多（后者约为前者速度的10倍），对啤酒熟化过程的时间起限制作用。如果在啤酒的熟化阶段α-乙酰乳酸不能充分除去，在随后的包装、杀菌过程中就会有较多的双乙酰形成，从而影响啤酒风味。若将α-乙酰乳酸脱羧酶用于啤酒生产，可以大大缩短啤酒熟化期，提高设备的利用率并且节省能源，具有一定的经济效益。

啤酒的风味成分有很多，其中双乙酰的含量直接影响啤酒的风味成熟。在成品啤酒中，双乙酰的浓度如果超过0.15mg/kg，会使啤酒的风味有馊饭味。因此，把啤酒中双乙酰含量降至口味阈值以下，被普遍认为是啤酒成熟过程的主要目标。

酶工程技术与食品添加剂在《食品生物技术》中的应用

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