食品生物技术：后基因组时代的代谢工程

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：后基因组时代的代谢工程的发展主要体现在以下几个方面：（一）高通量组学分析技术各种高通量组学分析技术的发展大大提高了系统分析微生物代谢功能的能力，尤其是提高了反向代谢工程中分析鉴定特殊表型遗传机制的能力。将其中3个突变基因导入野生型，获得了目前生产速率最高的赖氨酸生产菌。截至2017年已经完成了涵盖139种微生物的329个代谢网络模型。

从1995年第一个细菌流感嗜血杆菌全基因组序列测定开始，各种微生物全基因组测序以及重要微生物群落元基因组测序发展迅速。大量微生物全基因组序列的测定和功能基因组学技术的涌现，能够从整体上认识微生物代谢网络；能够从基因、RNA、蛋白质、代谢物、代谢通量等多个层次系统地分析微生物代谢，极大地推动了代谢工程和微生物发酵工业的发展。后基因组时代的代谢工程的发展主要体现在以下几个方面：

（一）高通量组学分析技术（high-throughput omics analysis）

各种高通量组学分析技术的发展大大提高了系统分析微生物代谢功能的能力，尤其是提高了反向代谢工程中分析鉴定特殊表型遗传机制的能力。

1.比较基因组学

这是直接对比分析微生物基因组序列的技术。通过对具有特殊表型的突变菌进行全基因组测序并和野生型基因组进行比较，直接鉴定出突变基因（或调控因子）。Ikeda研究小组比较了高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌突变菌和野生型菌株的基因组序列，成功鉴定出一系列和赖氨酸生产相关的突变基因。将其中3个突变基因导入野生型，获得了目前生产速率最高的赖氨酸生产菌。通过这种“基因组育种”重新构建的工程菌遗传背景清晰，没有多余的对细胞生长代谢造成负面影响的随机突变，适合更好地进一步遗传改造。

2.转录组学

是利用DNA芯片对比分析细胞mRNA的技术。高密度DNA芯片技术的发展大大提高了基因组水平基因转录的分析能力，使得同时分析多个样品的mRNA相对含量成为可能。对具有特殊表型的突变菌和野生型菌株或对同一菌株在不同时空、不同培养条件下的转录组对比分析，可以快速鉴定出转录水平显著变化的基因，从而指导遗传改造的靶点。Lee研究小组分析了生产人类胰岛素生长因子Ⅰ的重组大肠杆菌在高细胞密度培养条件下的转录组，鉴定出转录水平显著下降的200个基因。对其中与氨基酸和核苷酸合成相关的2个基因进行扩增表达，大大提高了胰岛素生长因子Ⅰ的生产。

3.蛋白质组学

是利用2-D胶对比分析细胞蛋白质图谱的技术。蛋白质图谱的对比分析可以在2-D胶上快速鉴定出蛋白质含量显著变化的位点；结合质谱分析可鉴定出该位点所对应的蛋白质。由于细胞的大部分代谢活性直接由蛋白质控制，因此蛋白质组学相比转录组学更进一步加深了对细胞代谢功能的理解。Lee研究小组利用蛋白质组分析发现生产瘦素（leptin）的重组大肠杆菌中，丝氨酸合成途径中的某些蛋白质含量显著下降，这表明丝氨酸类氨基酸的供给可能受到限制。其中半胱氨酸合成酶基因的扩增表达有效地提高了细胞生长和瘦素的生产。

4.代谢组学

是高通量定量分析细胞内代谢物的技术。核磁共振（NMR）、气质联用（GC-MS）、液质联用（LC-MS）和气相色谱—飞行时间质谱仪（GC-TOF）的开发大大提高了分析胞内代谢物的能力。代谢组学分析提供的是整合的信息，因此很难将代谢物浓度的变化和特定的基因突变联系起来；由于代谢物浓度直接和代谢途径相关联，因此可以指导应该对哪些途径进行改造。Microbia公司结合转录组和代谢组分析，使土曲霉（Aspergillus terreus）生产洛伐他汀（Lovastatin，降低胆固醇的药物）的能力提高了50%。

5.通量组学

是分析细胞内代谢通量的技术。通量分析可以获知细胞内哪些代谢途径有活性，活性有多高，从而更好地了解某个特定时空点上细胞的代谢情况。由于胞内的代谢通量很难直接测定，一般都是采用同位素标记底物并分析细胞蛋白质中氨基酸的标记状态、再结合数学模型计算的方法进行测定。和代谢组学分析类似，通量组学得到的也是整合的信息。Nielsen研究小组对比分析了高产和低产青霉素的青霉菌（Penicillium chrysogenum）的代谢通量，发现高产青霉素的能力和戊糖磷酸途径的高通量相关。(www.chuimin.cn)

6.组学分析技术的整合

各种组学分析技术各有所长，将它们整合在一起能最大限度地了解细胞的代谢功能。这一方面有很多成功的案例。Ikeda研究小组利用比较基因组学技术分析了高产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌突变菌的戊糖磷酸途径相关基因，鉴定出6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的点突变使该酶对胞内代谢物的变构抑制不敏感。通量组分析表明该突变使赖氨酸生产过程中戊糖磷酸途径的通量提高了8%，从而提高了还原型辅酶Ⅱ（NADPH）的供给。Wittmann研究小组分析了生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌在批式培养发酵不同阶段的转录组、代谢组和通量组，发现葡萄糖利用速率的降低导致细胞由生长转为生产赖氨酸、代谢通量由三羧酸循环（TCA循环）转为回补羧化和赖氨酸合成。在这一转化过程中，胞内代谢物有短暂的动态变化：赖氨酸在胞内累积到40mmol/L。虽然赖氨酸的代谢通量显著提高了，但赖氨酸合成相关的基因表达水平基本不变。这些研究为进一步提高细胞的赖氨酸生产能力鉴定了很多关键的基因靶点。Degussa公司利用了转录组、蛋白质组和通量组分析提高大肠杆菌生产苏氨酸的能力。他们在重复使用补料分批发酵技术强化生产工艺时发现，苏氨酸的生产能力越来越差。通量组分析表明磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶途径的碳通量显著提高，转录组分析表明编码该酶的基因及其下游的一些基因被显著激活。敲除该基因和其他一些靶点基因使苏氨酸的生产速率提高了40%。

（二）基因组水平代谢网络模型（Genome-scale metabolic models）

早期的细胞代谢网络结构分析主要是依据已知的生化反应、酶法测定和同位素标记法获得相关信息；微生物全基因组序列的测定以及基因功能注释工具的开发极大地促进了基因组水平代谢网络模型的构建，进而提高了分析代谢网络结构的能力。Palsson研究小组在1999年构建了第一个微生物基因组水平代谢网络模型（流感嗜血杆菌）。截至2017年已经完成了涵盖139种微生物的329个代谢网络模型。这些模型有助于从系统水平认识复杂的微生物代谢网络、预测细胞生理属性、预测遗传改变或环境扰动后细胞的代谢应答、模拟筛选出遗传改造的靶点基因。Stephanopoulos研究小组运用大肠杆菌代谢网络模型成功鉴定出单一或多个基因敲除目标，使细胞在保持良好生长速率的同时能提高番茄红素的产率；Maranas研究小组运用大肠杆菌代谢网络模型开发的OptKnock程序能鉴定出特定的基因敲除目标，使细胞生长速率的提高和目标产物生产速率的提高互相偶联，他们联合Palsson研究小组用实验证明了这一方法可以有效提高乳酸的生产速率；Maranas研究小组开发的OptStrain程序能够从已知的酶催化反应数据库中筛选出合适的酶催化反应，用于在模式微生物宿主中有效合成新化合物；他们还开发了OptReg程序用于预测各基因表达最优水平，从而提高目标产物的产率。

（三）改善细胞性能的新方法

代谢工程和微生物工业发酵的核心问题是改善细胞性能。组学分析技术和基因组水平代谢网络模型虽然大大提高了系统分析微生物代谢网络结构和代谢功能的能力，但实际应用仍有一定的局限性。组学分析技术目前主要是对比分析细胞性能已经获得改善的突变菌和野生型菌株，可并不能指导如何改善细胞性能。代谢网络模型虽然在一定程度上可以预测细胞生理属性以及预测遗传改变或环境扰动后细胞的代谢应答，但由于目前的模型很不完善，还没有结合动态的代谢变化，所以其指导如何改善细胞性能的能力还非常有限，已报道的成功案例非常少。与此同时，科学家们开发了一些其他的方法来有效地改善细胞性能。

1.进化代谢工程（Metabolic evolution）

是利用适应进化有效提高微生物发酵生产速率、产率和终浓度的技术。在微生物发酵过程中，底物利用过程一般产生能量（ATP）和还原力（NADH）；而很多产物的合成过程则是消耗还原力。通过遗传改造可以构建出初级的微生物细胞工厂，使目标产物成为唯一能够消耗还原力的代谢途径，从而使能量产生和还原力平衡相偶联。因此，通过在发酵反应器中连续传代培养微生物，筛选生长速率越来越快的突变菌，可以同步筛选出目标产物生产速率、产率和终浓度均显著提高的突变菌。Ingram研究小组利用此技术，成功提高了大肠杆菌发酵生产乙醇、L-乳酸、D-乳酸等化合物的生产性能，效果显著（提高1～2个数量级）。作者本人结合途径理性设计和代谢进化，成功构建了大肠杆菌代谢工程菌，使其能高效生产L-丙氨酸、丁二酸。其中L-丙氨酸工程菌能使用简单无机盐培养基，在厌氧批式培养条件下，48h内生产115g/L的L-丙氨酸，产率达到95%，手性纯度达到99.5%，生产成本大大低于目前使用的酶催化技术。

2.合理调控代谢途径表达

代谢合成途径的高效表达很多时候不仅受限于某个单一的限速反应步骤，而是需要多个酶的协同平衡。以前经常使用的单一酶的质粒高表达很多时候会造成细胞代谢的高负荷，对生长代谢合成均不利。近年来，科学家们开发了多种方法来合理调控代谢途径表达的平衡。一种常用的方法是合成启动子文库（synthetic promoter libraries）：科学家们构建了用于调控多种模式微生物（大肠杆菌、乳酸菌、酿酒酵母）基因表达的一系列组成型启动子文库，使基因的表达水平可以在很大范围内进行调节。具体技术主要有通过改造启动子-10和-35区域的间隔序列来控制启动子的强弱和通过使用易错PCR技术在原始启动子序列上造成随机突变的方法，获得基因表达强度差异很大的一组启动子文库。另一种常用的合理调控代谢途径表达的方法是转录后调控（Post-transcriptional control）。Keasling研究小组开发了一种新型的调控合成操纵子上多个基因协同合理表达的技术方法，构建了可调控基因间区域（Tunable intergenic regions, TIGRs）文库来实现这一目标，其中可调控的因子有mRNA二级结构、RNA酶切位点、核糖体结合位点序列等。这些可调控的因子可以改变基因的表达终止、mRNA稳定、翻译起始，从而达到协同调节多个基因合理表达的目标。这一技术被成功用于优化大肠杆菌代谢工程菌中外源甲羟戊酸（Mevalonate）途径的多基因合理表达，使甲羟戊酸的产量提高了7倍。

3.全局扰动技术（Global perturbation）

在优化微生物生理性能时，很多情况下不知道明确的靶基因和调控因子。过去科学家们大多是通过随机诱变的方法获得生理性能优化了的突变菌株。然而这种方法会引起微生物基因组上的随机突变，其中很多对细胞生长代谢不利。突变菌株虽然提高了特定的生理性能，但同时也伴随了很多负面作用。近年来，科学家们开发了多种全局扰动技术，对微生物基因组有针对性地改变，结合高通量筛选目标生理性能，从而获得遗传背景清晰的代谢工程菌。全局扰动技术主要有3种。①转座子突变（Transposon mutagenesis）：可以在微生物全基因组上造成随机基因敲除。科学家们优化了这一方法，使转座子能更均匀地随机插入基因组。使用热不对称交错PCR（Thermal asymmetric interlaced PCR）技术和基因芯片技术，可以迅速鉴定出转座子插入基因组的位置。Stephanopoulos研究小组使用该技术，快速鉴定出3个基因的敲除能提高大肠杆菌工程菌番茄红素的产量。②质粒编码的基因组文库（Plasmid-encoded library）：通过大量表达质粒编码的基因组文库，随机提高一个或多个基因的表达，从而提高目标产物的合成。Gill研究小组开发了一种多尺度分析文库富集的方法（Multiscale analysis of library enrichment, SCALEs），能够快速鉴定表达水平提高了的基因。③全局转录机器改造（global transcription machinery engineering, gTME）：通过易错PCR造成关键转录机器组分突变，从而系统改变细胞转录组的技术。通过改造原核生物的sigma因子（σ70）或是真核生物的TATA结合蛋白质及其关联因子，可以有效地提高细胞的抗逆性能以及目标产物的合成。StepHanopoulos研究小组使用该技术，成功提高了细胞对乙醇和十二烷基硫酸的抗性，以及提高了细胞合成番茄红素的能力。其他重要的全局扰动技术还包括：转录因子改造（Transcription factor engineering）、核糖体改造（Ribosome engineering）、基因组重排技术（Genome shuffling）等。

食品生物技术：后基因组时代的代谢工程

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