食品生物技术的早期代谢工程发展

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：通常，柔性及半柔性节点是代谢工程设计的主要对象。在代谢工程发展初期，用于调控细胞代谢网络的策略通常分3步。图4-7早期代谢工程基本研究思路早期代谢工程用于改善工业微生物发酵的范例之一是氨基酸发酵工业。虽然代谢工程在改造某些微生物提高其发酵性能中取得了很大的成功，但是早期有相当一部分改造并没能取得预期的效果。反向代谢工程早期最成功的应用范例是利用透明颤菌血红蛋白来缓解供氧不足。

相对人类实际应用而言，活细胞自身固有的代谢网络遗传特性并不是最佳的。为了大量积累某种代谢产物，就必须打破微生物原有的平衡状态，对细胞的代谢途径进行修饰，而这种修饰是以代谢网络为基础。代谢工程引入了代谢网络理论，将细胞的生化反应以网络整体来考虑，而不是孤立地来考虑，从而对细胞进行代谢流分析（metabolic flux analysis, MFA）。具体而言，就是把细胞的生化反应看做一个整体，假定细胞内的物质、能量处于拟稳态，通过测定不同途径或不同条件下胞外物质浓度，根据所有细胞内主要化学计量模型及物料平衡计算细胞内的代谢流向，得到细胞完整的代谢流分布图，包括细胞代谢的整个网络以及网络中主要节点代谢物的流量精细分布，并针对细胞内外环境的不稳定性，揭示细胞代谢的动态变化规律，为改善细胞培养工艺以及相应的基因操作提供重要依据。因此了解微生物的代谢网络，是代谢工程研究的基础。

根据代谢网络理论，将代谢网络分流处的代谢产物称为节点，将其中对终产物合成起决定作用的少数节点称为主节点，但节点不是绝对固定的。按照节点下游分支的可变程度，节点分为柔性、半柔性和刚性3类。对于柔性节点，解除一个分支的反馈抑制可提高分支下游产物的产量，即柔性分支点倾向于更适应通量分配比的变化；而对于半柔性节点，因占主导地位的酶活性较高或对结点代谢物亲和力较大且无反馈抑制，只解除次要分支的反馈调节，对其下游产物的影响不大，必须降低主分支的酶活力或解除其反馈抑制，才可提高次分支下游产物的产量。对于刚性节点，由于产物的反馈抑制及对另一分支酶激活的相互作用，其下游各分支的比例不易被改变，不能通过改变上游酶活性影响下游代谢流，也即刚性分支点抵抗通量分配比的变化。这样，通过比较由不同操作条件的变化及用不同变异株所导致的分支点通量分配比的变化，就可评估分支点的柔性或刚性。通常，柔性及半柔性节点是代谢工程设计的主要对象。如果代谢网络中各节点集中于产物，各节点的重要性相同，这类网络称为相依网络。其中的刚性节点很难改变，给代谢工程的实现带来困难。如果代谢网络的主节点不集中，称为独立网络，则可以通过对代谢途径的修饰等来影响产物的积累。对代谢修饰的应答能力，取决于各节点的刚柔性及其位置。

如何有效地调控细胞代谢网络，从而改善细胞性能（如提高细胞发酵生产能力、扩大底物利用范围、优化生理性能、合成新化合物），是代谢工程的核心思想，也是微生物发酵工业中的核心问题。在代谢工程发展初期，用于调控细胞代谢网络的策略通常分3步。①首先分析细胞代谢网络结构，找出代谢网络中的关键节点。早期的细胞代谢网络结构分析主要依据已知的生化反应。大部分重要工业微生物的主要代谢途径都已经被研究得非常透彻，对于未知的重要代谢途径，主要是通过酶法测定和同位素标记法来获得相关信息。②采取合适的遗传改造方法，在关键节点处进行遗传改造，从而改变细胞的代谢网络和代谢通量分布。常用的方法有基因敲除、基因扩增表达、基因整合、解除调控、反义RNA技术等。③对遗传改造后细胞的生理特征、细胞代谢进行详细分析，从而决定是否进行新一轮代谢工程操作。早期的分析手段主要是研究细胞生理性能；代谢流分析（Metabolic flux analysis, MFA）用于定量分析胞内代谢网络中各分支的代谢通量；代谢控制分析（Metabolic control analysis, MCA）、途径热力学分析（Thermodynamic analysis）和动态模型（Kinetic modeling）用于分析胞内代谢通量是如何被控制的。早期代谢工程的基本研究思路见图4-7，其中设计策略是基础，遗传修饰是关键，代谢分析则决定是否需要进行新一轮的代谢工程循环。

图4-7　早期代谢工程基本研究思路(www.chuimin.cn)

早期代谢工程用于改善工业微生物发酵的范例之一是氨基酸发酵工业。Stephanopoulos研究小组分析了生产苏氨酸的乳糖发酵棒杆菌（Corynebacterium lactofermentum）的代谢网络，确定天冬氨酸半醛是苏氨酸合成的关键节点；通过扩增表达反馈抑制不敏感的高丝氨酸脱氢酶和野生型高丝氨酸激酶，可以将大部分从天冬氨酸半醛流往赖氨酸合成的代谢通量转入高丝氨酸和苏氨酸合成；进一步提升高丝氨酸激酶对高丝氨酸脱氢酶的比例，可以减少高丝氨酸的积累，使更多的代谢通量转入苏氨酸合成，从而使苏氨酸的终浓度提高120%。代谢工程的策略也大大提高了其他重要氨基酸的发酵生产能力，如谷氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等。

虽然代谢工程在改造某些微生物提高其发酵性能中取得了很大的成功，但是早期有相当一部分改造并没能取得预期的效果。最主要的原因是人们对大部分微生物的生理遗传背景、酶反应特性、代谢网络结构的了解还不是很透彻。与此同时，传统微生物发酵工业在几十年的发展过程中，已经获得了很多具有特殊生理性能的野生菌以及发酵能力显著提高的突变菌株。在此基础上，Bailey等在1996年首次提出了另一种代谢工程策略——反向代谢工程（Inverse metabolic engineering），研究思路是在获得预期表型的基础上，“运用反向遗传策略”鉴定出相应的遗传基础；再将鉴定的遗传特性转移到工业菌株中，使其也具有同样的表型。

反向代谢工程早期最成功的应用范例是利用透明颤菌血红蛋白来缓解供氧不足。最初研究发现透明颤菌在供氧不足的环境下大量合成一种血红蛋白，这种特殊表型提示该菌在供氧不足时通过合成血红蛋白来提高代谢和生长。Bailey研究小组克隆了透明颤菌的血红蛋白基因，并通过在大肠杆菌中表达该基因，大大地提高了大肠杆菌在微氧环境中的生长。该遗传特性随后被转移至其他多种重要工业微生物，有效地促进了细胞生长和产物合成。反向代谢工程的策略虽然非常有效，但早期的发展受到很多限制，最重要的两点因素是：①如何有效地获得预期的表型；②如何高效快速地鉴定出特殊表型所对应的基因型。传统的物理化学诱变结合高强度筛选的方法效率比较低：诱变时在微生物基因组上引起的是随机突变，目的性不强；随机突变给下一步基因型鉴定带来很大的困难。这些问题随着后来功能基因组学的发展得到了很大的改善。

食品生物技术的早期代谢工程发展

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