非理性分子设计与定向进化在食品生物技术中的应用

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：根据这种情况，非理性设计，特别是定向进化法逐渐受到重视。非理性设计或定向进化就是在不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在实验室条件下模拟自然进化的过程，在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择所需要的特性突变物，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，得到具有预期特性新蛋白质的一种蛋白质工程技术。

理性设计是在蛋白质天然结构的基础上进行修饰改造，但产生一个结构确定、具有新功能特性蛋白质并不容易，无法满足对现有蛋白质进行分子改良的要求。这是由于蛋白质的性质涉及折叠结构、机械强度、动力学等诸多信息，而人们对这些蛋白质后加工的信息的掌握程度还远远不够，所以常规的设计方法往往无法达到目的。根据这种情况，非理性设计，特别是定向进化法逐渐受到重视。非理性设计或定向进化就是在不清楚蛋白质三维结构信息和作用机制的情况下，在实验室条件下模拟自然进化的过程（随机突变、重组和选择），在一定条件下使基因发生大量变异，然后通过多轮高通量的筛选方法定向选择所需要的特性突变物，在较短时间内完成漫长的自然进化过程，得到具有预期特性新蛋白质的一种蛋白质工程技术（见图4-4）。

图4-4　蛋白质体外定向进化的一般流程

目前，比较经典的定向进化技术有易错PCR技术和DNA改组技术等，而新兴的技术则是在这两种技术的基础上改进发展起来的。

（一）易错PCR技术

易错PCR是非重组型构建突变文库的方法，最早是由Arnold研究组于1993年首次提出，是最早出现并应用于基因随机突变的方法（见图4-5）。易错PCR是利用Taq DNA聚合酶，或改变PCR反应体系的条件，在DNA聚合过程中随机引入错配碱基，其突变位点发生在分子内部。由于普通的Taq DNA聚合酶不具有3'→5'外切酶活力，在扩增过程中不可避免地发生一些碱基的错配。在扩增体系因素发生改变如改变Mg2+浓度或使用Mn2+代替Mg2+作为DNA合成酶的激活剂时可以使错配率提高。易错PCR无须改变基因的长度，突变频率可以根据反应条件进行相应的控制，并且能有效地获得理想突变体，在蛋白质定向进化中得到了广泛应用。该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，属于无性进化。使用该方法易出现同型碱基转换。易错PCR只能使原始蛋白质中仅有很小的序列空间发生突变，因而一般适用于较小的基因片段（＜800bp）。在易错PCR基础上，Gratz和Jose发明了重叠延伸蛋白域文库法，它克服了易错PCR突变率低的缺陷，可以在预期的区域内进行随机突变。

（二）DNA改组技术

美国人Stemmer基于DNA同源重组原理于1994年首先提出了DNA改组技术，随后由该技术发展起来的新的随机突变技术不断被报道。与易错PCR技术相比，DNA改组可被用来进行多个同源基因的重组，且由于该法在片段组装过程中有可能引入点突变，因此也可用以指导单一序列的进化。基于DNA同源重组而实现的随机突变方法主要有：有性PCR、随机引物体外重组、交错延伸和临时模板随机嵌合等。

（1）有性PCR　是对一组相关基因用DNase I或超声波进行切割产生随机大小的DNA片段，再用无引物PCR将其连接成为接近目的基因长度的DNA分子，再利用基因两端序列为引物扩增全长基因。突变库经历了DNA片段的重新组装，与高错误倾向PCR有本质的不同。该方法由多个亲本参与进化，引入了重组、缺失、重复等多种突变类型，并且可以迅速积累有益突变，使表达蛋白质的平均活性明显提高（见图4-5）。(www.chuimin.cn)

（2）随机引物体外重组　是用随机引物在DNA模板上扩增DNA片段，再用类似有性PCR的方法组装成全长基因。该方法对模板DNA需求量小，并可对较短的DNA分子进行优化，在扩增DNA片段时可同时引入错配碱基，产生点突变，获取比有性PCR更广泛的突变库。

（3）交错延伸　是在PCR反应体系中，加入一组相关亲本DNA作模板，在随后的多轮变性和短暂复性、延伸过程中，使延伸片段在不同的具有部分同源序列的DNA模板间跳转，最终形成全长杂合基因突变库。该方法的基因重组程度可通过控制反应条件和时间予以调节，仅需在一个反应管中进行，简化了有性PCR操作。

（4）临时模板随机嵌合　与以上介绍的DNA洗牌技术不同，它是将随机切割的DNA片段杂交到另一个同家族DNA临时模板上，DNA片段经过在模板上重新排序、修剪、缺口连接等形成全长DNA新链，消化掉临时模板，获得高度重组的基因文库。其优点是重组率高，可以获得小于5bp的重组片段，且突变子具有较高的继承性，从而得到更多的活性克隆。

最近发展的串联重复插入（tandem repeatinsertions, TRINS）是一种通过滚环复制将原始基因以串联重复序列的形式（有时不止一个重复）插入到目的基因中的方法。尽管TRINS局限于使用特定的短序列片段，但能够鉴定蛋白质中的特定区域，并且TRINS通过模拟自然进化中的复制插入机制，避免了文库的过分膨胀，当高通量筛选条件受限时，TRINS将发挥十分重要的作用（见图4-5）。

图4-5　不同随机进化的基本技术流程

（a）易错PCR，改变PCR反应条件，产生随机突变；（b）点饱和突变，将模板DNA的特定位点突变为所有20种氨基酸；（c）DNA重组，将一组同源基因用DNase I消化，得到的随机产物互为引物和模板进行PCR扩增，当来源不同的片段之间相互形成模板时，即发生重组；（d）串联重复插入，将一组基因用CircLigase消化，再使用连接酶将其连接成环，并以此作为模板进行PCR反应，不同的串联重复序列发生随机连接，得到目的文库。

非理性分子设计与定向进化在食品生物技术中的应用

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