食品生物技术：理性分子设计和定位突变

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：（一）理性分子设计从蛋白质工程的发展历史来看，早期蛋白质工程的技术就是基因定位突变。图4-1蛋白质理性分子设计流程图第二，从天然蛋白质的三维结构出发，利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸。目前常用的定位突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定位突变，重组PCR介导的定位突变及盒式突变等。重组PCR介导的定位突变优点是操作较简单，突变的成功率可达100%。

（一）理性分子设计

从蛋白质工程的发展历史来看，早期蛋白质工程的技术就是基因定位突变。即在已知蛋白质三维结构与功能的基础上，利用专一改变基因中某个或某些特定核苷酸的序列，对一段最可能影响蛋白质功能与性质的基因序列进行定位突变，有目的地改变蛋白质的某一两个氨基酸残基或模块，从而构建全新的蛋白质分子，这种思路被称为理性分子设计。

基于天然蛋白质结构的理性分子设计过程基本分为以下步骤（见图4-1）。

第一，了解蛋白质三维结构。目前蛋白质数据库（PDB）已收集了15000多种蛋白质的晶体结构。当对某一天然蛋白质进行分子设计时，首先要查找PDB，了解这个蛋白质X射线晶体学及核磁共振谱（NMR）方法测定的蛋白质的三维结构，或者通过结构预测的方法构建该蛋白质三维结构模型。PDB是一个世界性的免费三维生物大分子结构数据处理和发布的数据库，是美国Bookhaven国家实验室负责建立、保存和分发X射线衍射和NMR方法测定的蛋白质、核酸和碳水化合物三维结构的数据库。其他相关蛋白质数据库还有美国生物技术信息中心（NCBI）数据库，欧洲分子生物学实验室数据库系统（EBI/EMBI）等。

图4-1　蛋白质理性分子设计流程图

第二，从天然蛋白质的三维结构出发（实验测定或预测），利用计算机模拟技术确定突变位点及替换的氨基酸。蛋白质结构与功能的关系对于蛋白质工程分子设计是至关重要的。如果想改变蛋白质的性质，必须清楚蛋白质功能与结构的关系。一般应注意如下问题：①应确定对蛋白质折叠敏感的区域，这些区域包括带有特殊扭角的氨基酸（例如羟脯氨酸、甘氨酸或天冬氨酸）、盐桥、密堆积区等；②当进行互换或插入/删除残基时应考虑它们对结构特征的影响，如疏水堆积、侧链取向、氢键、盐桥等，同时也应考虑它们对蛋白质功能的影响；③应确定对功能非常重要的位置，这些可以从结构与功能关系、生物化学或蛋白质工程实验及结构上考虑。

第三，利用能量优化及蛋白质动力学方法预测修饰后的蛋白质结构，并将预测的结构与原始的蛋白质结构进行比较。利用蛋白质结构、功能或结构/稳定性相关知识及理论计算，预测新蛋白质可能具有的性质。

上述设计工作完成后、要进行合成或突变实验并经分离、纯化及表征后得到所要的新的蛋白质。

（二）定位突变

定位突变是在已知蛋白质结构与功能的基础上，在已知DNA序列中取代、插入或删除特定的核苷酸，从而产生具有新性状的突变蛋白质（酶）分子的一种蛋白质工程技术。与化学及辐射诱变方法相比，定位突变具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。其作为一种研究手段，也广泛应用于蛋白质的结构与功能关系的研究，从而阐明基因的调控机制、疾病的病因和机制等。

目前常用的定位突变方法主要有寡核苷酸引物介导的定位突变，重组PCR介导的定位突变及盒式突变等。

1.寡核苷酸引物介导的定位突变(www.chuimin.cn)

寡核苷酸引物介导的定位突变的原理是用含有突变碱基的寡核苷酸片段作引物，在聚合酶的作用下启动DNA分子进行复制，将引物中的突变引入到基因中。其主要过程见图4-2。

从图中可看出该方法有下述6个步骤：①将待突变基因克隆到突变载体上；②制备含突变基因的单链模板；③引物与模板退火5'端磷酸化的突变寡核苷酸引物，与待突变的核苷酸形成一小段碱基错配的异源双链的DNA；④合成突变链：在DNA聚合酶的催化下，引物以单链DNA为模板合成全长的互补链，而后由连接酶封闭缺口，产生闭环的异源双链的DNA分子；⑤转化和初步筛选异源双链DNA分子转化大肠杆菌后，产生野生型、突变型的同源双链DNA分子，可用限制性酶切法、斑点杂交法和生物学法来初步筛选突变的基因；⑥对突变体基因进行序列分析。

寡核苷酸引物介导的定位突变的优点是保真度比重组PCR介导的定位突变高，缺点是操作环节复杂、周期长，而且在克隆待突变基因时会受到限制性酶切位点的限制。此外，该法常产生突变效率低的现象，主要原因是大肠杆菌中存在甲基介导的碱基错配修复系统。

图4-2　寡核苷酸引物介导的定位突变

2.重组PCR介导的定位突变法

PCR反应的出现推动了定位突变的发展，以PCR介导的定位突变为基因修饰、蛋白质改造提供了另一条途径。如通过改变引物中的某些碱基而改变基因序列，达到有目的地改造蛋白质结构和研究蛋白质的结构和功能之间关系的目的。还可以在所设计的引物5'端加入合适的限制性内切酶位点，为PCR扩增产物后续的克隆以及蛋白质的分子裁剪拼接提供方便。

经典PCR介导的定位突变，需要4种扩增引物，进行3次PCR反应（见图4-3）。前两次PCR反应中，应用两个互补的并在相同部位具有相同碱基突变的内侧引物，扩增形成两条有一端可彼此重叠的双链DNA片段，去除未参入的多余引物之后，这两条双链DNA片段经变性和退火可以形成具有3'凹末端的异源双链分子，在TaqDNA聚合酶的作用下，产生含重叠序列的双链DNA分子。这种DNA分子再用两个外侧寡核苷酸引物进行第三次PCR扩增，便产生突变体DNA。

重组PCR介导的定位突变优点是操作较简单，突变的成功率可达100%。但有两个缺点：①后续工作较复杂，PCR扩增产物通常需要连接到载体分子上，然后才能对突变的基因进行转录和转译；②Taq DNA聚合酶保真性偏低，因此PCR方法产生的DNA片段要经过核苷酸序列测定，方可确证有无发生其他突变。

图4-3　　PCR介导的定位突变

3.盒式突变

盒式突变是利用一段人工合成的含基因突变序列的寡核苷酸片段，取代野生型基因中的相应序列。这种突变的寡核苷酸是由两条寡核苷酸组成的，当退火时，按设计要求产生克隆需要的黏性末端，由于不存在异源双链的中间体，因此重组质粒全部是突变体，突变效率很高。如果将简并的突变寡核苷酸插入质粒载体分子上，在一次实验中便可以获得数量众多的突变体，大大减少了突变需要的次数，这对于确定蛋白质分子中不同位点氨基酸的作用是非常有用的方法。特别是对蛋白质中指定位置的氨基酸残基，进行一系列不同氨基酸残基取代以考察取代效果时，非常有效。因此，盒式突变具有简单易行、突变效率高等优点，还可以在一对限制酶切位点内一次突变多个位点，但缺点是合成多条引物的成本较高。

食品生物技术：理性分子设计和定位突变

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