动物细胞培养基组成与制备的关键信息

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：目前所有细胞培养室都已采用经标准化生产、组分和含量都相对固定的各种合成培养基，如Eagle基本培养基，简称MEM，是由13种必需氨基酸、8种维生素、葡萄糖和无机盐所组成。大多数动物细胞培养必须在培养基中添加血清，但在许多情况下，细胞可在无血清条件下维持和增殖。目前合成培养基的配方都已相对固定，并形成配制好的干粉型商品。

（一）培养基种类

动物细胞培养基划分为天然培养基、合成培养基和无血清培养基3个阶段：天然培养基阶段是对动物细胞培养基最初的也是最原始的研究阶段，营养成分高，为合成培养基阶段的到来打下了坚固的基础。但其成分复杂，个体差异大，重现性低，来源较为缺乏，因而使用受到限制。合成培养基阶段在天然培养基阶段的基础上发展较为迅速，可以通过添加某些成分支持细胞增殖。小牛血清成为合成培养基最常用的添加成分，虽然小牛血清中含有很多支持细胞生长的活性物质但同时也给细胞培养造成了诸多的不利。无血清培养基阶段旨在寻求血清的替代成分，既能满足细胞培养的要求又能避免血清引起的一系列问题。无血清培养基的发展共分为4代，前3代存在很多缺点，如适用谱窄、培养基难以保存、容易受到外界因素的影响等。

1.天然培养基

动物血清是细胞培养中用量最大的天然培养基，血清含有丰富的营养物质，包括大分子蛋白质和核酸等，对动物细胞的生长繁殖具有促进作用。同时，血清对细胞贴壁和保护亦有明显作用，且能中和有毒物质的毒性，使细胞不受伤害。这种培养基适合自然降压灭菌。

2.合成培养基

合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质模拟合成的，具有一定的组成。但这种模拟不是被动和不加选择的，而是在体外反复实验和筛选、进行强化和重新组合后形成的人工合成培养基。这种培养基在很多方面有天然培养基无法相比的优点。它给细胞提供了一个近似体内生存环境，又便于控制和标准化的体外生存环境。目前所有细胞培养室都已采用经标准化生产、组分和含量都相对固定的各种合成培养基，如Eagle基本培养基，简称MEM，是由13种必需氨基酸、8种维生素、葡萄糖和无机盐所组成。还有其他更复杂的如NCTC109，TC199，HEM, DME, RPMI1640，McCoy5A, HAMF12等。尽管现代的合成培养基成分和含量已经较为复杂，但仍然不能完全满足体外培养细胞生长的需要。在合成培养基中都或多或少地要加入一定比例的天然培养基加以补充。目前多采用胎牛血清、小牛血清、马血清等，比例从百分之几到百分之几十不等，要根据需要而定。其他各种天然培养基也可根据需要加入。

合成培养基的种类虽多，但一般都含有氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和一些其他辅助性成分。

（1）氨基酸　必需氨基酸是动物细胞本身不能合成的，因此，在制备培养基时需加入必需氨基酸，另外还需要半胱氨酸和酪氨酸。而且由于细胞系不同，对各种氨基酸的需要也不同。有时也加入其他非必需氨基酸，氨基酸浓度常限制可得到的最大细胞密度，其平衡可影响细胞存活的生长速率。在细胞培养中，大多数细胞需要谷氨酰胺作为能源和碳源。

（2）维生素　基本培养基中只含B族维生素，其他维生素都靠从血清中取得。血清浓度降低时，对其他维生素的需求更加明显，但也有些情况，即使血清存在，它们也必不可少。维生素限制可从细胞存活和生长速率看出，而不是以最大细胞密度为指标。

（3）碳水化合物　碳水化合物是细胞生命的能量来源，有的是合成蛋白质和核酸的成分，主要有葡萄糖、核糖、脱氧核糖、丙酮酸钠和醋酸等。

（4）无机盐无机盐是细胞的重要组成部分之一，它们积极参与细胞的代谢活动。无机盐中Na+、K+、Mg2+、Ca2+、Cl-、、和等金属离子及酸根离子是决定培养基渗透压的主要成分。对悬浮培养，要减少钙，可使细胞聚集和贴壁最少，碳酸氢钠浓度与气相CO2浓度有关。

（5）有机添加剂　复杂培养基都含有核苷、柠檬酸循环中间体、丙酮酸、脂类、氧化还原剂如抗坏血酸、谷胱甘肽等及其他各种化合物。同样，当血清量减少时，必须添加这种化合物，它们对克隆和维持这些特殊细胞有益。

（6）血清　动物细胞培养中最常用的天然培养基是血清。这是因为血清中含有大量的细胞生长增殖所需的激素、生长因子、转移蛋白和其他营养物质，对于维持细胞较好的生长状态，促进细胞的生长与分裂增殖、中和某些物质的毒性起着一定的作用。最常用的是小牛血清、胎牛血清。人血清用于一些人细胞系。大多数动物细胞培养必须在培养基中添加血清，但在许多情况下，细胞可在无血清条件下维持和增殖。

目前合成培养基的配方都已相对固定，并形成配制好的干粉型商品。其成分趋于简单化，以能维持细胞生长的最低需求，而去除了不必要的成分。同时为适应某些特殊培养的需要补加一些新的成分，如培养杂交瘤细胞时采用DMEM培养基需补加丙酮酸钠和2-硫基乙醇；为增加细胞转化和DNA合成，有时补加植物血凝素（PHA）等。这些变化需根据实验和细胞的具体要求而定。

3.无血清培养基(www.chuimin.cn)

经过多年的研究及使用发现，动物细胞培养中使用血清有很多不利因素，主要集中在以下几方面：首先，血清有批次差异，不同批次血清间的生物活性和功能因子不一致，容易造成代谢产物和实验结果重现性差，需要大量验证工作；其次，血清的来源不稳定，成分不明确、有抑制生长的成分、不利于疫苗和单克隆抗体等目的产品的分离纯化；最后，存在污染外源病毒和致病因子的风险，容易被病毒和支原体感染。相比天然培养基、合成培养基等传统培养基，无血清培养基有着无可比拟的优势，即加入成分明确的血清替代成分，既能满足细胞的培养要求，又能有效避免因使用血清带来的诸多不利因素。概括起来，无血清培养基有以下好处：①可避免血清质量间的批次变动，提高细胞培养和试验结果的重复性；②避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染；③避免血清组分对试验研究的影响；④有利于体外细胞培养的分化；⑤可提高产品的表达水平并使细胞产品易于纯化。因此，无血清培养得到越来越广泛的应用，无血清培养技术的研究也越来越得到人们的重视。纵观无血清培养基的整个发展历程，大概可分为三代，第四代无血清培养基的研究开发也成为热点方向。这几代培养基的特点见表3-4。例如有人研究对比了用MesenCult-XF无血清培养液和10%胎牛血清培养液的人脐带间充质干细胞（UC-MSC）的形态、免疫表型、细胞周期、增殖分化潜能及对混合淋巴细胞反应的抑制作用。结果显示，采用MesenCult-XF无血清培养液培养的MSC平均传代倍增6.57±0.7倍，含血清培养液培养的MSC平均传代倍增4.59±0.45倍（P＜0.05），无血清培养液培养的MSC（65±5.2）%均为G0/G1期细胞，含血清培养液培养的MSC（62±3.1）%为G0/G1期细胞（P＞0.05）；无血清培养液培养的细胞均为MSC，有传代增殖潜能，传代可达临床治疗MSC细胞量，并可避免异种蛋白致敏。

表3-4　无血清培养基的发展过程

（二）培养基制备以及制备过程中应考虑的因素

虽然各种培养基的组成各有不同，但形成商品化的干粉型培养基的配制方法却大同小异。绝大多数合成培养基的生产都已标准化、商品化。较为常用的培养基市场上很容易购得。这种干粉型培养基性质稳定，便于储存、运输、价格便宜，给使用和配制合成培养基带来很大方便。一般的特殊需求也多可在现有合成培养基基础上补加或调整某些成分予以满足。以往实验室自购各个组分，称量后再按一定顺序进行溶解配制的老方法，一方面需购置大量各种各样的成分，而且每种成分用量很少，很难控制和统一；另一方面要精确称量，顺序溶解，步骤烦琐，质量难以保证。除因特殊需要而专门配制一些特殊培养基外，大部分已不再使用。

在制备培养基时，通常要考虑以下因素：

1.pH

多数细胞系在pH 7.4下生长得很好。尽管各细胞株之间细胞生长最佳pH变化很小，但一些正常的成纤维细胞系以pH 7.4～7.7最好，但多数细胞对酸的耐受性较强，在偏碱性条件下则会很快死亡。转化细胞以pH 7.0～7.4更合适。据报道，上皮细胞以pH 5.5合适。为确定最佳pH，最好做一个简单的生长实验或特殊功能分析。

酚红常用作指示剂，pH 7.4呈红色，pH 7.0变橙色，pH 6.5变黄色，而pH 7.6呈红色中略带蓝色，pH 7.8呈紫色。由于对颜色的观察有很大的主观性，因而必须用无菌平衡盐溶液和同样浓度的酚红配一套标准样，放在与制备培养基相同的瓶子中。

2.缓冲能力

在细胞培养时，细胞的呼吸作用会产生很多CO2，和水结合会使培养基的pH下降（酸化），这样不利于细胞的培养，为了保证细胞的培养环境在一个合理的酸碱平衡环境，就需要在培养液中加入缓冲液，中和掉部分的CO2，来保证培养的pH平衡。常用的缓冲液有PBS磷酸盐缓冲液、HEPES缓冲液和NaHCO3缓冲液。碳酸盐缓冲系统由于毒性小、成本低、对培养物有营养作用，因此比其他缓冲系统用得多。这种系统气相中的CO2浓度应与培养液中的碳酸氢钠浓度相平衡。如果气相或培养箱空气中的CO2浓度设定在5%，那么培养液中NaHCO3的加入量为1.97g/L；如果CO2浓度维持在10%，那么NaHCO3的浓度则为3.95g/L。

3.渗透压

多数培养细胞对渗透压有很宽的耐受范围，一般常用冰点降低或蒸汽压升高测定。如果自己配培养基，可通过测定渗透压防止称量和稀释等造成的误差。

4.黏度

培养基的黏度主要受血清含量的影响，在多数情况下，对细胞生长没有什么影响。在搅拌条件下，用羧甲基纤维素增加培养基的黏度，可减轻细胞损害。这对在低血清浓度或无血清下条件下培养细胞显得尤为重要。

动物细胞培养基组成与制备的关键信息

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