食品生物技术影响植物细胞培养的因素

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：（二）培养环境由于各类代谢产物产生于代谢过程中的不同阶段，因此通过植物细胞培养进行次级代谢产物生产受到多种因素的影响。一般地说增加氮、磷和金属离子的含量会使细胞的生长加快，增加培养基中的蔗糖含量可以增加细胞培养物的次级代谢产物。另外，pH还会影响碳源和氮源的吸收，从而影响营养成分的吸收，导致细胞没有充分的营养物质和能量状态，从而影响次级代谢产物的合成。

植物细胞生长和产物合成动力学也可分为3种类型：①生长偶联型，产物的合成与细胞的生长呈正比；②中间型，产物仅在细胞生长一段时间后才能合成，但细胞生长停止时，产物合成也停止；③非生长偶联型，产物只有在细胞生长停止时才能合成。事实上，由于细胞培养过程较复杂，细胞生长和次级代谢产物的合成很少符合以上模式，特别是在较大的细胞群体中，由于各细胞所处的生理阶段不同，细胞生长和产物合成也许是群体中部分细胞代谢的结果。此外，不同的环境条件对产物合成的动力学也有很大的影响。

（一）细胞的遗传特性

从理论上讲，所有的植物细胞都可看作是一个有机体，具有构成一个完整植物的全部遗传信息。在生化特征上，单个细胞也具有产生其亲本所能产生的次级代谢产物的遗传基础和生理功能。但是，这一概念决不能与个别植株的组织部位相混淆，因为某些组织部位所具有的高含量的次级代谢产物并不一定就是该部位合成的，而有可能是在其他部位合成后通过运输在该部位上积累的。有的植物在某一部位合成了某一产物的直接前体而转运到另一部位，通过该部位上的酶或其他因子转化。如尼古丁是在烟草根部细胞内合成后输送到叶部细胞内的，另外有些次级代谢产物在植物某一部位形成中间体，然后再转移另一部位经酶转化而成。因此，在进行植物细胞的培养时，必须弄清楚产物的合成部位。同时，在注意到整体植物的遗传性时，还必须考虑到各种不同的细胞种类影响。

（二）培养环境

由于各类代谢产物产生于代谢过程中的不同阶段，因此通过植物细胞培养进行次级代谢产物生产受到多种因素的影响。各种影响代谢过程的因素都可能对它们发生影响，特别是在植物细胞培养放大过程中，碰到最大的问题就是次级代谢产物合成的降低，而这也是由于放大后的反应器中各种因素改变难以控制所造成的，因此，了解培养和代谢过程中的培养环境对于次级代谢产物的合成和积累的影响具有非常现实和积极的意义。这些因素主要包括有光、温度、搅拌、通气、营养、pH、氮源、前体添加剂、激素、诱导子和调节因子等。

1.光照影响

光对植物有特殊作用，光照时间的长短、光照量（光强度）和光谱特性（种类和波长）对次级代谢产物的产率都具有一定的影响。一般来说愈伤组织和细胞生长不需要光照，但是光对细胞代谢产物的合成有很重要的影响。例如，有人研究了光对花青素合成的影响。结果表明：蓝紫光有利于植物产花青素，如玫瑰茄细胞产花青素时，蓝光效率最高；其次，在低照射剂量的情况下，光照作为限制因子，这时，花青素的产量一般随光照强度的增加而增加，当光照到达一定强度时，增加光照剂量不会使花青素的产量提高；再次，Hiroyuki等对草莓细胞的研究表明，合适的光照间隔对花青素的合成有较大影响。

2.温度影响

温度是影响植物细胞生长的重要因素之一，无论是细胞培养物的生长或次级代谢产物的合成和累计，合适的温度都起着非常重要的作用，一般来说，植物细胞培养在20～25℃。但是，温度对次级代谢产物和细胞体的生长影响往往不一致。因此，在培养时，往往采用两步法，即细胞生长时采用某一温度，当细胞生长到一定阶段，需要收集次级代谢产物时，则采用另一温度。例如，Morris在长春花细胞培养试验时发现，细胞最大生长速率时的最佳温度为35℃，然而次级代谢产物生物碱的产率在20℃时最大。又如，张卫在草莓细胞培养生产花色苷时，在培养前3d，将细胞生长温度和次级代谢产物所需温度分别控制在30℃和20℃，这样花色苷的产量可以提高两倍多。

3.化学微环境

尽管植物细胞能在简单的合成培养基生长，但营养成分对植物细胞培养和次级代谢产物的生成仍有很大的影响。营养成分一方面要满足植物细胞的生长所需，另一方面要使每个细胞都能合成和积累次级代谢产物。普通的培养基主要是为了促进细胞生长而设计的，它对次级代谢产物的产生并不一定最合适。一般地说增加氮、磷和金属离子的含量会使细胞的生长加快，增加培养基中的蔗糖含量可以增加细胞培养物的次级代谢产物。蔗糖是常用的碳源，一般认为其被植物组织细胞内的蔗糖酶分解为葡萄糖和果糖后，再被细胞吸收利用，而且作为碳源，对于维持培养基的渗透压也非常重要。增加蔗糖浓度会减慢细胞生长并提高代谢物的积累，但是如果浓度过高，会导致生物合成能力丧失。作为植物组织生长必要的营养成分，氮、磷和金属离子对植物组织代谢的影响也很大。通常来讲，氮以铵盐和硝酸盐的组合形式被加入进培养基里面，研究表明，合适的铵态氮与硝态氮之比能促进细胞生长，提高次级代谢产物产量。磷以无机磷酸盐的形式供应和被细胞快速地吸收并主要以正磷酸形式在液泡中储存，通常是通过控制磷酸盐来调节次级代谢产物的合成。一般来说，提高起始磷浓度能提高细胞的生长，但对提高次级代谢产物的产量作用有限。由于金属离子能够使酶激活，因此在植物细胞培养中，通过增加金属离子来达到增加次级代谢产物含量的方法很普遍。例如，提高培养基中亚铁和钴离子浓度，能够提高长春花细胞中花青素的含量。又如在紫草细胞中提高铜离子浓度，对细胞生长和次级代谢产物的积累都具有明显的促进作用。所以，对于不同植物细胞的培养，化学微环境有很大不同，甚至相同一种物质对于细胞生长和次级代谢产物的合成都变化很大，因此，对于不同植物细胞培养，需要建立不同的化学微环境体系。

4.pH

pH是影响植物细胞培养的一个关键因素，植物细胞培养的最适pH一般在5～6。由于在培养过程中，培养基的pH往往有很大的变化，对培养物的生长和次级代谢产物的积累产生不利影响，因此在培养过程中，需要不断调整pH，使得细胞的生长和次级代谢产物的积累效果达到最优。胞外pH可能充当细胞发出信号的角色，因此可影响调控细胞生成次级代谢产物。另外，pH还会影响碳源和氮源的吸收，从而影响营养成分的吸收，导致细胞没有充分的营养物质和能量状态，从而影响次级代谢产物的合成。

5.搅拌和通气

植物细胞在培养过程中需要通入无菌空气，适当控制搅拌程度和通气量。在悬浮培养中更要如此。对摇瓶实验，通常500mL的三角瓶内装80～200mL的植物细胞培养液较适宜。在烟草细胞培养中发现，如果KLa≤5h-1，对生物产量有明显抑制作用。当KLa=5～10h-1，初始的KLa和生物产量之间有线性关系。当然不同的细胞系对氧的需求量是不相同的。为了加强气—液—固之间的传质，细胞悬浮培养时，需要搅动。植物细胞虽然有较硬的细胞壁，但是细胞壁很脆，对搅拌的剪切力很敏感，在摇瓶培养时，摇瓶机振荡范围在100～150r/min。由于摇瓶培养细胞受到剪切比较小，因此植物细胞很适合在此环境生长。实验室中采用六平叶涡轮搅拌桨反应器培养植物细胞，由于剪切太剧烈，细胞会自溶，次级代谢产物合成会降低。各种植物细胞耐剪切的能力不尽相同，细胞越老遭受的破坏也越大。烟草的细胞和长春花的细胞在涡轮搅拌器转速150r/min和300r/min时，一般还能保持生长。培养鸡眼藤的细胞时，涡轮搅拌器的转速应低于20r/min。因此培养植物细胞，气升式反应器更为合适。(www.chuimin.cn)

6.前体添加剂影响

与微生物细胞培养一样，植物细胞培养过程中前体物的添加也是影响次级代谢产物产量的重要因素。这些前体物在一系列酶的催化作用下，合成次级代谢产物，调节生命活动。因此在植物细胞的培养过程中，有时培养细胞不能很理想地把所需的代谢产物按所想象的得率进行合成，其中一个可能的原因就是缺少合成这种代谢物所必须的前体，因此在培养物中加入外源前体，也是调节植物次级代谢产物积累和合成的重要途径。在植物细胞培养过程中，选择适当的前体是相当重要的。对于所选择的前体除了要求增加产物产量之外，还要求无毒和廉价。但是，寻找能使目的产物含量增加最有效的前体是有一定难度的。目前应用比较多的几种前体物是苯丙氨酸、酪氨酸和肉桂酸等。在代谢过程中，苯丙氨酸作为代谢中间体，是合成黄酮类化合物、生物碱、木质素等次级代谢物质的前体，苯丙氨酸经裂解酶催化生成肉桂酸，最终催化合成黄酮类物质。前体物质在次级代谢产物中可作为底物，也可作为在催化途径中的关键酶参与反应。例如，苯丙氨酸是花青素合成的起始物质，相对于其他前体物质而言，苯丙氨酸便宜且诱导花青素非常有效，故常用来诱导花青素的积累。Kakegawa等的研究表明，高含量的苯丙氨酸可以促使花青素合成中相关酶PAL和CHS基因的表达，进而增加花青素的产量。JUN2ICHI等采用在培养过程中重复添加苯丙氨酸的方法，收到了良好的效果，分别比单添加和不添加处理的花青素产量分别提高了30%和81%。这说明在细胞培养过程中加入前体物苯丙氨酸，是提高花青素产量的有效措施。

虽然前体的作用在植物细胞培养中未完全清楚，可能是外源前体激发了细胞中特定酶的作用，促使次级代谢产物量的增加。有人在三角叶薯蓣细胞培养液中加入100mg/L胆甾醇，可使次级代谢产物薯蓣皂苷配基产量增加1倍。在紫草细胞培养中加入L-苯丙氨酸使右旋紫草素产量增加3倍。在雷公藤细胞培养中加入萜烯类化合物中的一个中间体，可使雷公藤羟内酯产量增加3倍以上。但同样一种前体，在细胞的不同生长时期加入，对细胞生长和次级代谢产物合成的作用极不相同，有时甚至还起抑制作用。如在洋紫苏细胞的培养中，一开始就加入色胺，无论对细胞生长和生物碱的合成都起抑制作用，但在培养的第二星期或第三星期加入色胺却能刺激细胞的生长和生物碱的合成。

7.诱导子影响

诱导子（elicitor）是指植物抗病生理过程中诱发植物产生植物抗毒素和引起植物过敏反应（hypersensitive reaction, HR，亦称抗性反应或自身防御反应）的因子。在活细胞体系中加入低浓度的诱导子能够诱导或次级特定化合物的生物合成。根据其来源可分为生物诱导子和非生物诱导子。生物诱导子主要包括病毒类诱导子、细菌类诱导子、酵母提取物、真菌类诱导子等。非生物诱导子主要可分为物理因子和化学因子两大类，常用的物理因子一般为高温、高压、电击、紫外线等一些能诱导植物产生抗病性的环境因素；化学因子主要有水杨酸、茉莉酸、稀土元素及重金属盐类等。利用诱导子刺激次级代谢产物的生成，不尽是在植物细胞培养时促进次级代谢产物产生的重要手段，同时在缩短工艺时间、提高反应器利用率等方面有显著的效果。有人研究了诱导子及高流体静压（highhydrostatic pressure, HP）对葡萄悬浮静压培养次级代谢产物的影响，结果表明在化学诱导子和HP的作用下，酚类物质的含量明显增加。

8.生长调节剂

在细胞生长过程中生长调节剂的种类和数量对次级代谢产物的合成起着十分重要的作用。植物生长调节剂不仅会影响到细胞的生长和分化，而且也会影响到次级代谢产物的合成。生长素和细胞分裂素有使细胞分裂保持一致的作用，不同类型的生长素对次级代谢产物的合成有着不同的影响。生长调节剂对次级代谢的影响随着代谢产物的种类的不同而有很大的变化，对生长调节剂的应用需要非常慎重。

9.培养设备

目前用于植物细胞培养的反应器主要有气升式（air-lift）、搅拌式（STR）、鼓泡式（bubble calum）、转鼓式（RDR）及其他改进式反应器。还有植物细胞固定化反应器和膜反应器等。各种反应器的特点见表3-2。

表3-2　各种生物反应器的优缺点

针对搅拌式反应器的局限性，研究工作者对反应器进行了大量的优化，主要集中在改进空气分布器、搅拌形式、叶片结构和类型等。这样能在保证氧和混合条件的情况下，尽量降低剪切力带来的不利影响。除此之外，就是对植物细胞进行驯化，建立起抗剪切力体系。

目前，在大规模植物细胞悬浮培养中，为了提高生物量和次级代谢产物量，一般采用二阶段法。第一阶段尽可能快地使细胞量增长，可通过生长培养基来完成。第二阶段是诱发和保持次级代谢旺盛，可通过生产培养基来调节。因此在细胞培养整个过程中，要更换含有不同品种和浓度的植物生长激素和前体的液体培养基。为了获得能适合大规模悬浮培养和生长快速的细胞系，首先要对细胞进行驯化和筛选，把愈伤组织转移到摇瓶中进行液体培养，待细胞增殖后，再把它们转移到琼脂培养基上。经过反复多次驯化筛选得到的细胞株，比未经过驯化、筛选的原始愈伤组织在悬浮培养中生长快得多。

毋庸置疑，在过去几十年中，植物生物技术方面已取得了相当巨大的进展，大大缩短了向工业化迈进的距离。国内有关单位对药用植物，人参、三七、紫草、黄连、薯蓣、芦笋等已展开了大规模的细胞悬浮培养，并对植物细胞培养专用反应器进行研制。国外，培养植物细胞用的反应器已从实验规模1～30L，放大到工业性试验规模130～20000L，如希腊毛地黄转化细胞的培养规模为2000L，烟草细胞培养的规模最大已达到20000L。

值得注意的是，影响植物细胞培养物的生物量增长和次级代谢产物积累的因素是错综复杂的，往往一个因素的调整会影响到其他因素的变化。所以，需要在培养过程中不断加以调整，同时，由于不同的植物有机体有自身的特殊性，因此，对于一种植物或一种次级代谢产物适合的培养条件，不一定对其他的细胞或次级代谢作用适合。

食品生物技术影响植物细胞培养的因素

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