植物细胞大规模培养技术-食品生物技术

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。在相同的浓度下，大细胞团的培养液的表观黏度明显大于小细胞团的培养液的表观黏度。一般植物细胞培养中采用15%～20%的氧饱和度。

使用大规模细胞培养技术是近些年来非常流行的技术之一。主要是因为用这种技术生产天然产物不受病虫害、气候、地理和季节等外界因素的影响，同时所得到的次级代谢产物的成分也较简单，对于后续的分离和提纯较容易。目前用于植物细胞大规模培养的技术主要有植物细胞的大规模悬浮培养和植物细胞或原生质体的固定化培养。

（一）植物细胞的大规模悬浮培养

悬浮培养通常采用水平振荡摇床，可变速率为30～150r/min，振幅2～4cm，温度24～30℃。适合于愈伤组织培养的培养基不一定适合悬浮细胞培养。悬浮培养的关键就是要寻找适合于悬浮培养物快速生长，有利于细胞分散和保持分化再生能力的培养基。

1.悬浮培养中的植物细胞的特性

由于植物细胞有其自身的特性，尽管人们已经在各种微生物反应器中成功进行了植物细胞的培养，但是植物细胞培养过程的操作条件与微生物培养不同。与微生物细胞相比，植物细胞要大得多，多数为10～100μm，呈球形或柱形，平均直径要比微生物细胞大30～100倍。除少数细胞外，绝大多数植物细胞在悬浮培养时是结成直径小至100μm大到2mm的小团。其主要原因是由于细胞分化后不能很好地分开，另外细胞生长后期分泌的多糖物质也有助于植物细胞结团。过大的细胞团容易下沉，造成混合困难，同时影响传质，使培养中心的营养物质和氧浓度不够，从而影响次级代谢产物的合成能力。然而结团可以形成一个从颗粒中心到表面的一个传质梯度，起到类似于细胞分化的作用，这在一定程度上有助于细胞次级代谢产物的合成。根据细胞系来源、培养基和培养时间的不同，这种细胞团通常由以下几种方式存在：①在细胞分裂后没有进行细胞分离；②在间歇培养过程中细胞处于对数生长后期时，开始分泌多糖和蛋白质；③以其他方式形成黏性表面，从而形成细胞团。当细胞密度高、黏性大时，容易产生混合和循环不良等问题。不同细胞系结团情况不同，即便是同一种细胞，在不同的培养环境，不同的培养阶段所形成的结团情况也不同。由于植物细胞培养时，次级代谢产物的积累和合成受结团影响很大，所以在放大培养时，细胞结团差异是一个研究者需要特别注意的一个方面。

由于植物细胞的生长速度慢，操作周期就很长，即使间歇操作也要2～3周，半连续或连续操作更是可长达2～3个月。同时由于植物细胞培养培养基的营养成分丰富而复杂，很适合真菌的生长。因此，在植物细胞培养过程中，保持无菌相当重要。

2.植物细胞培养液的流变特性

在植物细胞培养后期，由于聚集体的形成、生物量的增大，培养液表现出复杂的流变学特性，大多数植物细胞体系表现出非牛顿型以及切稀型流体的特性。由于植物细胞常常趋于成团，且不少细胞在培养过程中容易产生黏多糖等物质，使氧传递速率降低，影响了细胞的生长。当前，还没有对流体性能的综合在线研究，对于植物细胞培养液流变特性的认识还很肤浅，普遍使用的是用黏度仪测定不同转速下的液体黏度。培养过程中培养液的黏度一方面由于细胞本身和细胞分泌物等存在，另一方面还依赖于细胞年龄、形态和细胞团的大小。在相同的浓度下，大细胞团的培养液的表观黏度明显大于小细胞团的培养液的表观黏度。在植物细胞培养中，流体性能直接影响到溶液的混合和物质传输，因而影响细胞的生长和次级代谢产物的生成。

3.植物细胞培养过程中的气相特性

所有的植物细胞都是好气性的，需要连续不断地供氧。由于植物细胞培养时对溶氧的变化非常敏感，太高或太低均会对培养过程产生不良影响，因此，大规模植物细胞培养对供氧和尾气氧的监控十分重要。与微生物培养过程相反，植物细胞对氧需求较微生物低，植物细胞培养过程并不需要高的气液传质速率，而是要控制供氧量，以保持较低的溶氧水平。

氧气从气相到细胞表面的传递是植物细胞培养中的一个基本问题。大多数情况下，氧气的传递与通气速率、混合程度、气液界面面积、培养液的流变学特性等有关，而氧的吸收却与反应器的类型、细胞生长速率、pH、温度、营养组成以及细胞的浓度等有关。通常也用KLa（氧传递系数）来表示氧的传递，它反映了通气与搅拌的综合影响。事实证明体积氧传递系数能明显地影响植物细胞的生长。

培养液中通气水平和溶氧浓度也能影响到植物细胞的生长。一般植物细胞培养中采用15%～20%的氧饱和度。Schlatman等在相同通气水平和搅拌速度的情况下，比较长春花细胞高密度培养时在15%和85%饱和度下的生物量和生物碱合成量，结果发现上面两种情况下的生物量无明显差异，可是85%的溶氧条件时的蛇碱含量比15%溶氧条件高5倍，这说明溶氧浓度对植物细胞培养的次级代谢产物的产生的影响比较大。

长春花细胞培养时，当通气量从0.25L/（L·min）上升至0.38L/（L·min）时，细胞的相对生长速率可从0.34d-1上升至0.41d-1；而当通气量再增加时，细胞的生长速率反而会下降。曾在不同氧浓度时对毛地黄细胞进行了培养，当培养基中氧浓度从10%饱和度升至30%饱和度时，细胞的生长速率从0.15d-1升至0.20d-1，如果溶氧浓度继续上升至40%饱和度时，细胞的生长速率却反而降至0.17d-1。这就说明过高的通气量对植物细胞的生长是不利的，会导致生物量的减少，这一现象很可能是高通气量导致反应器内流体动力学发生变化的结果，也可能是由于培养液中溶氧水平较高，以至于代谢活力受阻。

由上述情况可以看出，氧对植物细胞的生长至关重要，但是CO2、乙烯等气体在植物细胞培养时对细胞的生长特别是对次级代谢也有重要的影响。研究发现，植物细胞能非光合地固定一定浓度的CO2，如在空气中混以2%～4%的CO2能够消除高通气量对长春花细胞生长和次级代谢物产率的影响。此外，乙烯能抑制细胞生长，且刺激次级代谢产物的分泌。而CO2又能阻遏或延迟乙烯的作用，因此，对植物细胞培养来说，在要求培养液充分混合的同时，乙烯、CO2和氧气的浓度只有达到某一平衡时，才会很好地生长。Pedersen等发现2%的CO2和21ppm的乙烯混合时，红豆杉产紫杉醇浓度最高。(www.chuimin.cn)

4.泡沫和表面黏附性

植物细胞培养过程中产生泡沫的特性与微生物细胞培养产生的泡沫是不同的。对于植物细胞来说，其培养过程中产生的气泡比微生物培养系统中气泡大，且被蛋白质或黏多糖覆盖，因而黏性大，细胞易被包埋于泡沫中，造成非均相的培养。此外，通气、搅拌和细胞外蛋白质的分泌也能够导致泡沫。尽管泡沫对于植物细胞来说，其危害性没有微生物细胞那么严重，但如果不加以控制，随着泡沫和细胞的积累，有时也会对培养系统的稳定性产生不利的影响。Raviwan等用颠茄细胞培养时发现，在泡沫形成30min后，存在于泡沫中的细胞有55%，90min后，存在于泡沫中的细胞达到75%。目前，有许多除泡剂已用于控制泡沫，但是有些除泡剂如硅油可能会对细胞的生长产生影响。因此，选择恰当的消泡剂对于植物细胞培养非常重要。

5.悬浮细胞的生长与增殖

由于悬浮培养具有3个基本优点：①增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；②可带走培养物产生的有害代谢产物，避免有害代谢产物局部浓度过高等问题；③保证氧的充分供给。因此，悬浮培养细胞的生长条件比固体培养有很大的改善。

悬浮培养时细胞的生长曲线见图3-3，细胞数量随时间变化曲线呈现S形。在细胞接种到培养基中最初的时间内细胞很少分裂，经历一个延滞期后进入对数生长期和细胞迅速增殖的直线生长期，接着是细胞增殖减慢的减慢期和停止生长的静止期。整个周期经历时间的长短因植物种类和起始培养细胞密度的不同而不同。在植物细胞培养过程中，一般在静止期或静止期前后进行继代培养，具体时间可根据静止期细胞活力的变化而定。

图3-3　悬浮培养时细胞的生长曲线

6.细胞团和愈伤组织的再形成和植株的再生

悬浮培养的单个细胞在3～5d内即可见细胞分裂，经过一星期左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂而形成肉眼可见的小细胞团。大约培养两周后，将细胞分裂再形成的小愈伤组织团块及时转移到分化培养基上，连续光照，三星期后可分化成试管苗。

（二）植物细胞或原生质体的固定化培养

经过多年的研究发现，与悬浮培养相比，固定化培养具有很多优点：①提高了次级代谢产物的合成、积累；②能长时间保持细胞活力；③可以反复使用；④抗剪切能力强；⑤耐受有毒前体的浓度高；⑥遗传性状较稳定；⑦后处理难度小；⑧更好的光合作用；⑨促进或改变产物的释放。

1979年，Brodelius首次将高等植物细胞固定化培养以获得目的次级代谢产物，此后，植物细胞的固定化培养得到不断的发展，逐步显示其优势。不完全统计，约有50多种植物细胞已成功地进行了固定化培养。

植物细胞的固定化常采用海藻酸盐、卡拉胶、琼脂糖和琼脂材料，均采用包埋法，其他方式的固定化植物细胞很少使用。

原生质体比完整的细胞更脆弱，因此，只能采用最温和的固定化方法进行固定化，通常也是用海藻酸盐、卡拉胶和琼脂糖进行固定化。

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