植物细胞培养基的组成和制备方法

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：（一）细胞培养基的组成确定植物细胞工业规模培养的培养基是个重要而复杂的问题。无论培养目标设计是针对细胞生长还是针对代谢产物的积累，其培养基主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。植物细胞需求的氮源一般为无机氮源。表3-1常用植物细胞培养基的化学组成单位：mg/L续表（二）培养基的制备培养基中使用的无机盐、碳源、维生素和生长激素应该采用高纯度级的药品。

（一）细胞培养基的组成

确定植物细胞工业规模培养的培养基是个重要而复杂的问题。首先植物细胞培养基较微生物培养基复杂得多，且工业化培养基又不同于实验室用培养基，即便是工业化培养本身，甚至因培养目的及培养阶段不同而采用不同培养基。植物细胞大规模培养目的是生产细胞、初级代谢产物、次级代谢产物、疫苗或用于生物转化，迄今虽有几种已知成分培养基为人们普遍采用，但不同培养基培养结果不同。因此，需要根据不同培养对象、培养目的及培养条件探索适宜培养基。选择培养基的基本原则是培养过程使细胞总体积倍增，时间1d左右为宜，但适宜于细胞生长的培养基，不一定适合于生产次级代谢产物及其他目的，通常需根据培养目标设计相应培养基，如需生产次级代谢产物时，除选用促进细胞生长培养基外，尚需可提高次级代谢产品产率的培养基，待细胞生长至静止期时用以生产次级代谢产物。Morris在长春花细胞悬浮培养过程，对培养基进行组合研究并考察其蛇根碱、阿玛碱及其他生物碱产量的变化，发现细胞生长阶段和产物生产阶段采用不同培养基，各种产物均有不同程度增加，说明不同培养阶段必须采用不同培养基；又如锦紫苏悬浮细胞培养，首先从15种培养基种筛选出迷失香酸产率高的B5培养基，经试验又向其中添加2，4-二甲基苯氧乙酸作为激素，再用于培养锦紫苏细胞，产物生成量提高40%；又将蔗糖浓度由2%提高到7%，产物量又明显提高，且产物积累量可达到干细胞量13%～15%；因此，在培养的不同阶段采用不同培养基以促进细胞生长及其他目的，是十分重要的。

无论培养目标设计是针对细胞生长还是针对代谢产物的积累，其培养基主要由碳源、有机氮源、无机盐、植物生长激素、有机酸和一些复合物质组成。

（1）碳源　最常用的是蔗糖，葡萄糖和果糖也能使某些植物细胞生长的很好。木糖、山梨醇、麦芽糖、甘露糖、半乳糖和乳糖等也可作为某些形式的碳源被植物利用。

（2）有机氮源　通常采用的有机氮源有蛋白质水解物、谷氨酰胺或氨基酸混合物等。有机氮源对细胞的初级培养的早期生长阶段有利。L-谷氨酰胺可代替或补充某种蛋白质水解物。

（3）无机盐类　无机氮可以以两种形式供应，一种是硝酸态氮，另一种是铵态氮。植物细胞需求的氮源一般为无机氮源。有些培养基以硝酸态氮为主，有些则以铵态氮为主，多数情况下两者兼有。对于不同的培养形式，无机盐的最佳浓度是不相同的。通常在培养基中无机盐的浓度应在25mmol/L左右。硝酸盐浓度一般采用25～40mmol/L，虽然硝酸盐可以单独成为无机氮源，但是加入铵盐对细胞生长有利。如果添加一些琥珀酸或其他有机酸，铵盐也能单独成为氮源。培养基中必须添加钾元素，其浓度为20mmol/L，磷、镁、钙和硫元素的浓度在1～3mmol/L。

（4）植物生长激素　大多数植物细胞培养基中都含有天然的和合成的植物生长激素。植物生长激素分成生长素和细胞分裂素两类。生长素在植物细胞和组织培养中可促使根的形成，植物细胞常用的生长激素有2，4-D、IAA、NAA以及KT等。细胞分裂素通常是腺嘌呤衍生物，又称作为细胞激动素。使用最多的是玉米素（Z）和6-苄氨基嘌呤（BA）。其在调节种子萌发，脱黄化，叶绿体分化，花及果实发育和叶片衰老等方面起作用。通常情况下，细胞分裂素和生长素被一起使用，促使细胞分裂及生长，其配比视情况而定。其使用量在0.1～10mg/L，根据不同细胞株而异。

（5）有机酸　加入丙酮酸或者三羧酸循环中间产物如柠檬酸、琥珀酸、苹果酸，能够保证植物细胞在以铵盐作为单一氮源的培养基上生长，并且耐受钾盐的能力至少提高到10mmol。三羧酸循环中间产物，同样能提高低接种量的细胞和原生质体的生长。

（6）维生素　如维生素B1、维生素B6、肌醇等。

（7）核酸及其水解物　如DNA、RNA、黄嘌呤、次黄嘌呤、腺嘌呤、鸟嘌呤及胸腺嘧啶等。

（8）其他成分　如氯化胆碱、胆质素、胶氨酸、苹果酸及反丁烯二酸等。(www.chuimin.cn)

（9）制备固体培养基时则需加琼脂。

（10）复合物质　通常作为细胞的生长调节剂，如酵母抽提液、麦芽抽提液、椰子汁和苹果汁。目前这些物质已被已知成分的营养物质所替代。在许多例子中还发现，有些抽提液对细胞有毒性。目前仍在广泛使用的是椰子汁，在培养基中浓度是1～15mmol/L。

目前应用最广泛的基础培养基主要有MS、B5、E1、N6、NN和L2等（见表3-1）。

表3-1　常用植物细胞培养基的化学组成

单位：mg/L

续表

（二）培养基的制备

培养基中使用的无机盐、碳源、维生素和生长激素应该采用高纯度级的药品。生长激素、2，4-D和NAA等在使用前需要重结晶提纯，其酒精—水溶液要用吸附法脱色处理。对于像2，4-D、IAA和NAA这样难溶于水的试剂，配溶液时可先溶于2～5mL酒精中，然后慢慢加入蒸馏水，稍微加热，稀释至所需体积，再调节pH。配制培养基应采用蒸馏水或者高纯度的去离子水。在培养基配制过程中可用0.5mol/L的HCl或0.2mol/L NaOH调节pH，固体培养基加入琼脂0.6%～1.0%，120℃蒸汽灭菌15～20min。对于一些热敏性化合物，应该用过滤法灭菌，如L-谷氨酰胺、植物生长激素、椰子汁等，然后再按无菌操作加入到已灭菌的培养基中。

由于培养基配比中有些组分量很小，种类又很多，配制起来很烦琐。因此往往把培养基配成使用浓度的10倍或100倍的母液，分成小瓶后冷冻保存，使用时再稀释到正常浓度。经稀释后的培养基应放在10℃以下冰箱中保藏。为了防止在高浓度下培养基组分间相互作用产生沉淀，CaCl2、KI和EDTA钠铁盐等要单独配制保存，使用时再稀释混合。

植物细胞培养基的组成和制备方法

相关推荐