食品生物技术中细胞融合技术的步骤

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：采用病毒促进细胞融合，如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒及一些致癌病毒等均能诱导细胞融合。其中仙台病毒是最早应用于动物细胞融合的融合剂。电脉冲诱导细胞融合技术产生于20世纪80年代，目前已成为细胞融合的有效手段之一。

细胞融合技术的主要过程包括：①制备原生质体。对于微生物和植物细胞具有坚硬的细胞壁，通常用酶将其降解，动物细胞则无此障碍。②诱导细胞融合。两亲本细胞（原生质体）置于高渗溶液中，在促溶剂和CaCl2存在的条件下，促使两者相互凝集并发生细胞之间的融合。悬浮液调至一定的细胞密度混合后，采用物理、化学或生物学的方法诱导细胞融合。③筛选杂合细胞。将上述混合液移至特定的筛选培养基上，使杂合细胞生长，其他未融合的细胞无法生长，获得具有双亲遗传特性的杂合细胞。

（一）原生质体的制备

获得有活力、去壁较为完全的原生质体对于随后的原生质体融合和再生是非常重要的。影响原生质体制备的因素很多，主要有以下几个方面。

1.亲本的选择及预处理

在原生质体融合过程中，为便于后续融合体的筛选工作，一般首先对所用亲本进行遗传标记。常用的遗传标记有营养缺陷型、抗药性等。这种遗传性状可通过人工诱变等方法使亲本获得。

对于微生物细胞，取经过培养至对数期的细胞，在培养基中加入细胞壁合成的抑制剂如甘氨酸、青霉素或D-环丝氨酸等，可增加菌体对脱壁酶的敏感性。

对于植物细胞，原则上植物任何部位的外植体都可成为制备原生质体的材料。但人们往往更看重活跃生长的器官和组织，由此制得的原生质体一般都生命力较强，再生与分生比例较高。常用的外植体包括：种子根、子叶、下胚轴、胚细胞、花粉母细胞、悬浮培养细胞和嫩叶。对外植体的除菌要因材而异。悬浮培养细胞一般无须除菌。对较脏的外植体要先用肥皂水清洗再以清水洗2～3次，然后浸入70%酒精消毒后，再放进3%次氯酸钠处理，最后用无菌水漂洗数次，并用无菌滤纸吸干。

2.除壁酶的选择

细菌和放线菌可用溶菌酶处理。革兰氏阳性菌易被溶菌酶除去壁，但革兰氏阴性（G-）菌由于其成分及结构较复杂，必须采用溶菌酶和EDTA一起处理。酵母菌则用蜗牛酶，它是由蜗牛胃液制备而得名，商品名为“Helicase”。霉菌则往往添加几丁质酶及纤维素酶互相配合，从而达到细胞原生质体化的目的。

植物细胞的细胞壁含纤维素、半纤维素、木质素以及果胶质等成分，因此市售的纤维素酶实际上大多是含多种成分的复合酶，如中科院上海植物生理研究所生产的纤维素酶EA3-867和日本产的Onozuk R-10就含有纤维素酶、纤维素二糖酶以及果胶酶等。此外，蜗牛酶也较好的降解植物细胞壁的能力。

3.酶浓度

一般来说酶浓度增加，原生质体的形成率亦增大，超过一定范围，则原生质体形成率的提高不明显。酶浓度过低，则不利于原生质体的形成；酶浓度过高，则导致原生质体再生率的降低。为了兼顾原生质体形成率和再生率，有人建议以使原生质体形成率和再生率之乘积达到最大时的酶浓度为最适酶浓度。

4.酶解温度

温度对酶解作用有双重影响，一方面随着温度升高，酶解反应速度加快；另一方面，随着温度升高，酶蛋白变性而使酶失活。一般酶解温度控制在20～40℃。

5.酶解时间

充足的酶解时间是原生质体化的必要条件，但如果酶解时间过长，则再生率随酶解的时间延长而显著降低。其原因是当酶解达到一定时间后，绝大多数的菌体细胞均已形成原生质体，因此，再进行酶解作用，酶便会进一步对原生质体发生作用而使细胞质膜受到损伤，造成原生质体失活。

6.渗透压稳定剂

原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗或等渗溶液或培养基中才能维持生存，在低渗溶液中，原生质体会破裂而死亡。不同的菌种，采用的渗透压稳定剂不同。对于细菌或放线菌，一般采用蔗糖、丁二酸钠等为渗透压稳定剂；对于酵母菌则采用山梨醇、甘露醇等；对于霉菌采用KCl和NaCl等。

（二）原生质体融合

融合是把两个亲本原生质体混合在一起，通过诱导融合作用使原生质体发生融合。促进细胞融合的方法有如下几种。(www.chuimin.cn)

1.生物法

主要用于动物细胞的融合。采用病毒促进细胞融合，如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、副黏液病毒及一些致癌病毒等均能诱导细胞融合。其中仙台病毒（HVJ）是最早应用于动物细胞融合的融合剂。仙台病毒具有毒力低，对人危害小，而且容易被紫外线或β-丙炔内酯所灭活等优点，这是生物学法最常用的细胞融合剂。

本方法由于病毒的致病性和寄生性，制备比较困难。此外，本法诱导产生的细胞融合率比较低，重复性不高，所以近年来已不多用。

2.化学法

目前主要有盐类融合法、高钙和高pH融合法和聚乙二醇融合法3种。

（1）盐类融合法　此法是应用最早的诱导原生质体融合的方法。盐类融合剂对原生质体的破坏小。目前主要研究方向为提高融合率，使其对液泡化发达的原生质体能够诱发融合。

（2）高钙和高pH融合法　Keller首先发现高Ca2+和高pH可以诱发融合。Melchers用此法将烟草种内2个光敏感突变体诱导融合成功并获得100余株体细胞杂种。但是这种方法的应用范围有限。

（3）聚乙二醇融合法（PEG法）目前使用最普遍的化学融合剂为聚乙二醇。1974年，加拿大籍华人高国楠用聚乙二醇（PEG）为融合剂成功诱发大豆与大麦、大豆与玉米、哈家野豌豆与豌豆的融合。此法比病毒更易制备和控制，活性稳定，使用方便。用PEG作为病毒的替代物诱导细胞融合，是各种原生质体融合的主要方法。由于PEG与水分子以氢键结合，使自由水消失，导致高度脱水的原生质凝集融合。融合时必须有Ca2+参与，因为Ca2+和磷酸根离子结合形成不溶于水的络合物作为“钙桥”，由此引起融合。一般，PEG与DMSO并用时融合效果更佳。

3.物理法

目前主要有电脉冲诱导细胞融合技术、空间细胞融合技术、激光融合技术、离子束细胞融合技术和非对称细胞融合技术。

（1）电脉冲诱导细胞融合技术　产生于20世纪80年代，目前已成为细胞融合的有效手段之一。该技术融合效率高，是PEG的100倍，操作简单、快速、对细胞无毒无害，可在显微镜下观察融合全过程。

（2）激光融合技术　1987年和1989年，德国海德堡理化研究所采用准分子激光器使油菜原生质体融合，从开始照射到完全融合仅需几秒钟。该法可选择任意两个细胞进行融合，易于实现特异性细胞融合，作用于细胞的应力小，定时定性强，损伤小，参数易于控制，操作方便，可利用监控器清晰观察整个融合过程，实现重复性好，无菌物毒性，但它只能逐一处理细胞。

（3）空间细胞融合技术　植物细胞融合过程中由于地球重力的存在，有无液泡的原生质体密度差很大，异源细胞融合率低。在利用动物细胞融合生产单克隆抗体过程中，在地球上由于无法排除重力的影响，要提高B淋巴细胞和骨髓瘤细胞的融合得率相当困难。

（4）离子束细胞融合技术　20世纪80年代证实了离子注入生物效应和粒子沉积生物效应的存在，建立了质量、能量、电荷三因子作用机制体系，据此原理发展了该技术，离子束的可操作性高，可用微束对细胞进行超微加工，有目的地切割染色体，通过消除部分染色体或染色体的某些片段达到细胞非对称融合的目的。但是这项技术目前还停留在研究阶段，一旦获得成功，将改变传统的一对一细胞融合的弊端，减少供体细胞导入的染色体范围，使融合更具目的性，大大减少筛选的工作量，将是细胞融合研究的一大进步。

（5）非对称细胞融合技术　是利用某种外界因素（如γ射线）辐照某一细胞原生质体，选择性地破坏其细胞核，并用碘乙酰胺碱性蕊香红6G处理在细胞核中含有优良基因的第二种原生质体，选择性地使其细胞质失活，然后融合来自这2个原生质体品系的细胞，实现所需胞质和细胞核基因的优化组合，实践表明非对称细胞融合技术通过γ射线、X射线照射为实现供体亲本少数基因的转移，创造种间、属间杂种提供了可能性。

（三）原生质体的再生

原生质体失去了细胞壁，是失去了原有细胞形态的球状体。尽管它们具有生物活性，但毕竟不是正常细胞，在普通培养基平板上也不能正常地生长、繁殖。为此，必须想办法使其细胞壁再生长出来，以恢复细胞原有形态和功能。原生质体的再生，必须使用再生培养基，再生培养基由渗透压稳定剂和各种营养成分组成。影响原生质体再生的因素主要有菌种的特性、原生质体制备条件、再生培养基成分、再生培养条件等。

（四）融合子的选择

融合子的选择主要依靠两个亲本的选择性遗传标记，在选择性培养基上，通过两个亲本的遗传标记互补而挑选出融合子。但由于原生质体融合后会产生两种情况，一种是真正的融合，即产生杂合体或重组体；另一种是暂时的融合，形成异核体。两者均可以在选择培养基上生长，一般前者较稳定，而后者不稳定，会分离成亲本类型，有的甚至可以异核状态移接几代。因此，要获得真正融合子，必须在融合体再生后，进行几代自然分离、选择，才能确定。

食品生物技术中细胞融合技术的步骤

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