基因工程在微生物中的应用

发酵工业的关键步骤之一是如何获取优良菌株，除常用的诱变、杂交和原生质体融合等传统方法外，与基因工程结合，大力改造菌种，给发酵工业带来了生机，如能表达目的基因的“基因工程菌”的开发。微生物的遗传变异性及生理代谢的可塑性都是其他生物难以比拟的，故其资源的开发有很大的潜力。下面介绍基因工程在微生物中的几方面应用。

（一）酿酒酵母菌株

1.啤酒

在过去的20多年里，人们对啤酒酵母的遗传改造做了大量的研究。现在筛选出的菌株能发酵多种来源的碳水化合物，其絮凝性状也发生了改变，而且，所生产出的啤酒可以具有不同的口味。

（1）碳水化合物的利用　酿酒酵母只能利用单己糖、双己糖和三己糖。为了能够利用和分解代谢其他的寡聚物，如糊精或β-葡聚糖，通常选用以下几种不同的途径，即表达不同来源的葡萄淀粉酶和β-葡聚糖酶基因。β-葡聚糖的消除使得啤酒的滤透性增加，因此，它就成为一个既能扩大底物应用范围又能改善啤酒生产工艺的实例。

（2）絮凝沉淀　一个好的酿酒酵母应该能够形成絮凝沉淀，因为这是在发酵临近结束时对酒液进行澄清最为经济和有效的方法。酿酒酵母之所以产生絮凝沉淀，完全取决于该菌株是否为新絮凝因子（New Flo）表现型。Flo1基因可编码一个细胞表面蛋白，通过导入源自实验室酵母菌株的Flo1基因，工业酵母的絮凝能力已得到改善，在整个发酵过程中都可以观察到絮凝沉淀现象，这才致细胞数量下降和发酵时间延长。使用生长时期特异性启动子HSP30，经过证实可以对Flo1基因的表达进行调控，基因的高效表达控制在生长的末期时稳定。

（3）口味　基因工程还可用于改变啤酒的口味，可以将一些多余化合物消除掉，如双乙酰和硫化氢，还可以使一些与口味有关的化合物如二氧化硫保持稳定。双乙酰是啤酒口味不够纯正的一个主要原因，它是缬氨酸生物合成途径中的一个产物。在发酵过程中，α-乙酰乳酸通过自发氧化作用形成双乙酰，然后通过酵母细胞扩散进入正在发酵的麦芽汁中。新制备的“绿色”啤酒需要经过一个既费时又费成本的后熟阶段，在这个过程中，双乙酰被缓慢转化成丙酮和2，3-丁二醇，这两种产物比双乙酰具有口味感。有许多方法可以避免冗长的后熟过程，关键是要减少双乙酰的形成。例如，通过导入异源的α-乙酰乳酸转化为丙酮，从而将后熟时间由几个星期缩短为几小时。构建重组酵母以减少硫化氢生成量的研究已证明是成功的，结果显示它可以缩短后熟所需要的时间和成本。一个比较有希望的途径是首先将硫酸盐代谢途径中的MET25基因置于糖酵解途径中的组成性启动子控制之下，然后将它们导入酿酒酵母的核糖体DNA中。使用这种方法，中试发酵试验证实硫化氢的含量比野生型酵母降低很多。

啤酒口味要保持一定的稳定性，取决于它所含的二氧化硫水平。改变二氧化硫的含量，已有多种基因工程的方法，如表达硫酸盐代谢途径中的各种基因。有些基因可改变代谢的方向，朝有利于增加二氧化硫含量的方向发展，如表达MET3和MET14。也有人试图让MET32和MET10基因失活，而后一种办法似比前几种方法更有希望获得成功。

2.葡萄酒

将重组技术应用于葡萄酒酵母的目的是改善其发酵特性、加工效率以及独特的口味。

（1）发酵特性　为了扩大碳源和氮源的同化范围及克服分解代谢物阻遏现象，基于对糖酵解和氮代谢途径所涉及的相关酶催化活性的了解，人们已开展过多种的探索和研究。为了更有效地利用糖分，有一个研究将所有参与糖酵解途径的酶都过量表达，但乙醇的含量并未得到提高。而另一个试验中，由于HXT通透酶基因家族的基因被表达，使得葡萄糖的吸收特异性地增加了。此外，在脯氨酸利用途径的去调控研究中发现，它可以克服分解代谢物阻遏并成功地提高氮源利用率（在厌氧发酵条件下，脯氨酸不被代谢利用）。

（2）加工效率　葡萄酒需经过精制和澄清阶段才能完成全部的加工过程，其间要减少某些化合物的含量。例如，多聚糖对葡萄汁和葡萄酒的澄清和稳定性都会产生不利的影响，因此，异源性或同源性的基因被表达以使酶能够将果胶质、葡聚糖及半纤维素（主要是木聚糖）降解。近来，在一个啤酒酵母菌株中表达一个内源性的PGU1基因，发现该葡萄酒的过滤时间有了显著缩短。这个重组菌株能够分泌有活性的内聚半乳糖醛酸酶，而该酶可以成为其他来自真菌的果胶酶的替代品。

（3）独特的口味　葡萄酒口味及其他触觉感官的改善与葡萄中萜类化合物、挥发性酯类以及甘油含量的高低密切相关，还有就是最后葡萄酒酸度的调节。萜类化食物是葡萄酒中理想的挥发性物质，也是葡萄的次生代谢产物，而这些萜类化合物绝大多数是以它们的前体化合物——非挥发性的O-葡萄糖苷形式存在的。通过将异源的长枝木霉的β-1，4-葡聚糖酶基因导入列葡萄酒酵母菌株中表达，葡萄酒的香味增加了，这可能是由于糖基化的香味化合物前体水解后造成的。在发酵初期所形成的酯类化合物含量变化非常大，这些化合物构成了独特的水果香味，其合成则需要乙酰转移酶的参与。由ATF1所编码的乙醇乙酰基转移酶（AAT）是啤酒酵母中研究得最清楚的酶之一，将ATF1基因置于组成型的PGK1启动子控制之下，然后导入商业化葡萄酒酵母中表达，使葡萄酒的口味有所改善，原因是增加了理想酯类化合物的合成。

甘油是非挥发性的化合物，主要与其他感官有关，如甜味、滑腻感、持久感以及葡萄酒的整体感观。表达甘油的研究目的是改善葡萄酒的感官。对于白葡萄酒而言尤其如此，这是因为它的甘油含量比红葡萄酒要低；Remize和他的同事们的研究表明，在表达GDP1基因的同时，让ALD7基因失活，可使甘油的产量比野生型对照菌株增加2～3倍（以减少乙醇为代价），同时也使乙酸含量降低。在葡萄酒中的有机酸主要是酒石酸和苹果酸，它们约占葡萄可滴定酸度的90%。如果不对其含量进行调整，将会使葡萄酒口味不正甚至变质。啤酒酵母同化L-苹果酸的能力所使用的菌株不同差异会非常大，主要原因是它们缺乏一个主动的苹果酸转移系统。除了啤酒酵母不能充分代谢苹果酸盐之外，苹果酸酶的底物特异性也很低。近来有研究将源自裂殖酵母的苹果酸通透酶和苹果酸酶基因导入到酿酒啤酒酵母中，结果发现可以使琴宁—布兰克（Chenin Blanc）葡萄汁中的L-苹果酸含量显著下降。

3.清酒

制作清酒的微生物包括清酒酵母（主要是啤酒酵母）和米曲霉。也有人用基因工程改造后的清酒酵母进行发酵以便改进清酒的风味和阻止有毒物质（通常是诱变剂）的产生。

（1）口味　清酒有玫瑰香味，这是因为它含有苯乙基乙醇和乙酸乙酯这两种化合物。对能增强芳香化合物合成的变异菌株进行筛选和研究发现，它们的ARO4基因有一个位点发生了变异。ARO4基因编码的芳香族氨基酸生物合成中的酶，将改造后的ARO4基因插入到一个着丝粒型的质粒上，然后转移到清酒酵母体内，结果发现用这种酵母所酿制的清酒中苯基乙醇含量增加。

（2）有毒物质　氨基甲酸乙酯（ECA）是一种可疑的致病物质，为阻止其形成，有人构建了一个重组的清酒酵母菌株。尿素被认为是酵母细胞中ECA合成的主要前体化合物，它在精氨酸降解过程中形成。在重组的清酒酵母菌株中，编码精氨酸酶的CAR1基因的两个拷贝被先后失活，目的是为了减少尿素的产生。研究发现，这种重组酵母可减少尿素积累，在清酒中没有监测到有ECA存在，即使在30℃存放5个月也是如此。

（二）面包酵母菌株(www.chuimin.cn)

面包是由发酵的面团（主要是小麦或其他禾谷类作物）制作成的，而酸面团的形成要借助于面包酵母和乳酸酵母。面包酵母的质量取决于生产过程中它是否能够进行有效的呼吸代谢，其结果将决定最后的产量（更经济一些），尽管在开始发酵时都是用少许蜜糖作引子。在面团发酵过程中，酵母也需要产生相当数量的二氧化碳，通过对不同糖分的乙醇发酵可以做到这一点；另外，酵母还产生其他的副产品，它们与面包的口味和香味相同。面包酵母的改善工作涉及几个方面，如对不同的面团底物进行发酵，从一定数量的蜜糖产生出足够量的酵母菌。

1.作用于不同的面团底物

面包酵母是否具有好的发酵能力取决于它利用麦芽糖效率的高低，而麦芽糖是面团中的内源性淀粉酶对淀粉水解后产生的。葡萄糖的存在可以限止麦芽糖进入酵母细胞及在酵母细胞中的代谢，这种代谢调控机制也被称为“分解代谢物阻遏”。葡萄糖调控也同样抑制麦芽糖酶和麦芽糖通过酶的合成以及使麦芽糖酶失活，这些将导致酵母利用麦芽糖的时间推迟。代谢基因工程可以减少葡萄糖调控所产生的不利影响，意味着需要以组成型方式表达MAL基因，同时还要使一些基因失活，如需失活MIG1基因。上述方案可以部分减轻葡萄糖调控的影响，并使葡萄糖和麦芽糖存在的情况下生长有所加快，由此导致面包生产时间缩短。当将葡萄糖调控中的一些特殊调控基因删除，使引物蔗糖代谢过程改变，结果也能缩短面包发酵时间。

2.生物产量

利用蜜糖作碳源和氮源，通过有氧补料分批方法可以生产面包酵母。蜜糖中主要含有葡萄糖、果糖、蔗糖和棉子糖，而棉籽糖通过转化酶可以转变为果糖和蜜二糖；只有少数几个面包酵母菌株能够同化蜜二糖，许多菌株中利用蜜二糖的基因（α-半乳糖苷酶）是缺失的。通过基因工程，在面包酵母中表达MEL1基因后，蜜二糖的利用能力得到恢复并由此增加了生物产量。为了提高生产效率，Blom等又提出了另外一种能缓解葡萄糖调控影响的研究策略，即通过表达转录因子Hap4p，可以部分减弱葡萄糖对呼吸代谢的抑制，乙醇的产量明显下降，而酵母生长速率有所提高，产量也增加了40%。

（三）乳酸菌发酵剂

20世纪80年代以来基因工程技术进入乳酸发酵剂领域，利用基因工程技术改造传统的发酵食品用微生物是当前食品生物技术领域一个新的研究热点。近10年来，基因工程技术主要应用于乳酸发酵工业以下几个方面：噬菌体抗性菌株的分子育种；质粒相关的稳定作用；增强干酪的风味和质构，加速干酪的成熟；细菌素和其他天然抗生素的产生；生物胶的产生；风味缺陷的控制；益生素的产生；食品级酶和异源蛋白质的产生；降低莫兹瑞拉干酪的棕色化；发展适用于低脂肪乳制品的发酵剂；发展冷敏感型发酵剂。大多数发酵食品中含有未灭活的发酵微生物，并随食品进入人体，因此利用基因重组技术改造食品用微生物时，首先应保证具有足够的安全性。有了食品级基因修饰菌的明确定义，美国、荷兰、丹麦等国的研究人员做了大量有关用基因工程技术改良乳制品发酵剂的研究。

乳酸菌是能代谢产生乳酸，降低发酵产品pH的一类微生物。乳酸菌基因表达系统分为组成型表达和受控表达2种类型，其中受控表达系统包括糖诱导系统、Nisin诱导系统、pH诱导系统和噬菌体衍生系统。相对于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）和嗜热链球菌而言，德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）的基因研究比较缺乏，但已发现质粒pN42和PJBL2用于构建德氏乳杆菌的克隆载体。乳酸菌基因突变有2种方法：第一种涉及（同源或异源的）可独立复制的转座子，第二种是依赖于克隆的基因组DNA片断和染色体上的同源部位重组整合而获得的。完整基因组序列的破译并没有改变这些基本方法，然而这已经极大地提高了选择用于研究基因位点的速度，而且现有的基因组序列大大提高了随机整合体的定位和预测遗传前景的能力。

（四）其他工业用酵母菌株

在西方国家，绝大多数植物来源的发酵食品都是用啤酒酵母的工业用菌株生产的。其他用于食品生产的工业用酵母种类包括裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）和露西结合酵母（Zygosaccharomyces rouxii），例如用谷子发酵生产啤酒、用棕榈汁发酵生产杜松子酒及用大豆发酵生产酱油。裂殖酵母也同样应用在朗姆酒的发酵生产中，另外由于它能够分解代谢苹果酸，还被用来调校葡萄酒的酸度。在生产生物大分子蛋白质及表达异源蛋白质方面，裂殖酵母也大有用武之地，在传统发酵食品的生产过积中，也能发现裂殖酵母，如波比啤酒和杜松子酒。至于菌株的改良工作，无论是采用传统的育种方法，还是通过基因工程途径都很少有报道，这可能与裂殖酵母在生物技术研究方面只具有较小的应用范围有关。

露西结合酵母是一个抗渗透能力比较强和嗜盐性的酵母，由于它的存在使得日本酱油和豆瓣酱具有独特的香味。采用改良菌株生产酱油已经得以实现，但菌株的改良只是通过简单的突受体筛选。研究发现，L-甲硫氨酸抗性突变体菌株不能够完全将甲硫氨酸转化为S-腺苷甲硫氨酸（SAM），由此导致甲硫基丙醇（3-甲硫基-1-丙醇）的含量增加了60倍，而这种物质是酱油中起决定作用的风味化合物。

在异源蛋白质的商业化生产方面，常选用其他一些有吸引力的酵母作为宿主菌，这些酵母包括了毕赤酵母、多形汉逊酵母和克鲁维如酵母等菌种。为实现外源蛋白质的高效表达，尽管也对这些酵母进行了遗传方面的改造工作，但都与食品原材料的生产没有任何关系。

（五）工业用丝状真菌菌株

在东方国家，植物类发酵食品的生产主要是借丝状真菌完成的，这些真菌包括曲霉（Aspergillus）、根霉（Rhizopus）和毛霉（Mucor）。大豆、水稻和花生的发酵都有这些真菌的参与。在日本，这些真菌的引子培养物被称为考剂（Koji），是一种传统的接种物，菌株的筛选主要是基于它们所含有的特殊酶类，如在酱油生产过程中，真菌菌株应该含有很高的蛋白水解酶和淀粉水解酶活性。而在利用稻米生产甜酒的过程中，真菌菌株则需要较高的淀粉水解酶活性，因为这样便于将淀粉转化为糖。

对引子培养物中的真菌菌株进行遗传改良将会产生新菌株，因此可生产出人们所希望的酶类、芳香化合物、有机酸和色素。改造工作也应该围绕着菌株对温度和高盐的耐受性开展，可供选择的方法包括通过基因工程途径，如原生质体融合技术。不同丝状真菌如曲霉、毛霉、青霉和木霉已可以通过原生质体融合及进行种内和种间杂交。在工业用引子培养物中，已有人使用遗传重组技术或依据其原理对它们进行改造。

有关丝状真菌转化技术的应用主要涉及在真菌中表达异源酶类、其他种类的蛋白质及有商业价值的次生代谢产物。尽管重组技术已广泛应用于一些可作为食品的真菌菌株上，但这些基因工程菌株在商业化生产的应用还很有限。在真菌引子培养物中，还没有一种GMO菌株获得批准进入商业化应用。利用基因工程手段克隆生长因子基因，将重组基因载体导入合适的微生物细胞，便能进行目标产品，如动物生长激素、蜘蛛丝蛋白等的发酵生产。应用微生物发酵生产除必须取得所需要的基因以外，还需选择合适的微生物，这种微生物必须是不致病的。此外还应该便于培养，产品能分泌到培养液中便于提取、转化，而且最好是对它有充分的了解等。美国食品和药品管理局已批准用基因工程菌生产凝乳酶用来制造奶酪；英国的农业、渔业与粮食部已批准用基因工程面包酵母生产面包；芬兰的一家酒精生产公司首先用基因工程芽孢杆菌生产α-淀粉酶；日本也有不少关于应用基因工程菌于食品添加剂的报道。用生物技术手段可以生产动、植物的新品种，从而获得新食品。例如，人类应用遗传工程手段已经培育出高赖氨酸的玉米、高蛋白的小麦、无毒素的棉籽等，改善了日常食品的质量，丰富了食品资源，各种细菌和酵母菌的发酵藻类为人类提供了新型的营养来源。

尽管世界范围内对基因食品的争议很多，但并不影响基因食品技术的迅速发展，新的基因食品不断问世。可以预计，基因食品在新世纪将很快成为人类食品的主要来源。我国对转基因技术和基因食品的研究和应用采取了积极扶持的政策，在转基因水稻、小麦、番茄、甜椒等方面已达到国际同类研究领先水平。只有培育出高产的粮食作物及基因工程食品，才能满足日益增多的人口对食物的巨大需求，这也是发展基因工程食品最重要的驱动力。尽管目前还难以让人们从观念上完全接受基因工程对食品工业的改造，但在过去几年里利用分子生物学技术生产的基因食品不断问世，从牛奶、奶酪到水果、蔬菜、牲畜以及玉米、大豆等主要农作物范围广泛，其销售量也在稳步上升。基因工程的应用已经渗透到工业生产的许多领域，现代基因工程技术将为农业带来新的绿色革命，给人们带来更加丰富、更有利于健康、更富有营养的食品，将为人类的衣食住行发挥巨大力量。