DNA测序方法-食品生物技术

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：DNA测序是DNA分析的一个基本内容。（一）Sanger双脱氧链终止法这个方法是由英国剑桥大学分子生物学实验室的生物化学家Sanger等发明的一种简单快速的DNA测序方法。基本原理是利用DNA聚合酶合成DNA, DNA聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序。那么经过反应后，将会产生出不同长度的DNA片段混合物。最后在放射性X光底片上，直接读出DNA序列。Maxam-Gilbert DNA序列分析法所用的DNA片段，可以是单链也可以是双链。

DNA测序是DNA分析的一个基本内容。对于在分子水平上研究基因的结构和功能关系等有着十分广泛的实用价值。

（一）Sanger双脱氧链终止法

这个方法是由英国剑桥大学分子生物学实验室的生物化学家Sanger等发明的一种简单快速的DNA测序方法。基本原理是利用DNA聚合酶合成DNA, DNA聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序。反应的终止依赖于反应底物2'，3'-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），它们与DNA聚合反应所需的底物2'-脱氧核苷三磷酸（dNTP）的结构相同，只在3'位是氢原子而不是羧基（见图2-21）。在DNA聚合酶作用下它们都能通过其5'三磷酸基团掺入正在增长的DNA的链中，形成磷酸二酯键。由于ddNTP缺乏3'羟基而不能同后续的dNTP或ddNTP形成磷酸二酯键，因此一旦ddNTP掺入DNA的新生链中，聚合反应就会立即终止，即在本来应是某个2'-脱氧核苷三磷酸（dNTP）掺入的位置上，发生了特异性的链终止效应。如果在4个反应管中，同时加入一种DNA合成的引物和待测序的DNA模板、DNA聚合酶I、4种脱氧核苷酸三磷酸（dTTP、dATP、dGTP、dCTP），并且在这4个管中分别加入4种不同的2'，3'-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）（ddTTP、ddATP、ddGTP、ddCTP），另外引物应有标记。那么经过反应后，将会产生出不同长度的DNA片段混合物。它们都具有同样的5'末端，带有ddNTP的3'末端。将这些混合物加到变性凝胶上进行电泳分离，可以获得一系列不同长度的DNA谱带。最后再通过放射自显影术，检测单链DNA片段的放射性带。最后在放射性X光底片上，直接读出DNA序列。

图2-21　脱氧核苷酸及双脱氧核苷酸结构比较(www.chuimin.cn)

（二）Maxam-Gilbert化学修饰法

1977年，美国哈佛大学的Maxam和Gilbert发展出了一种以化学切割为基础的DNA序列分析法，这种方法也称为Maxam-Gilbert DNA序列分析法。它的基本原理是用特殊的化学试剂处理末端放射标记的DNA片段，造成碱基的特异性切割，由此产生一组不同长度的DNA片段，然后利用电泳分离分析断裂片段的大小，放射自显影，观察显影图谱确定DNA序列。Maxam-Gilbert DNA序列分析法所用的DNA片段，可以是单链也可以是双链。在进行碱基特异的化学切割反应之前，需要先对待测的DNA片段末端进行标记。首先用碱性磷酸酶除去磷酸基团，用T4激酶标记其末端。然后将双链DNA分子变性得到两条单链，回收其中一条单链分子，分装在4个反应试管中，每管含有不同的特定化学试剂，只要严格控制反应条件，就可以使各管中的DNA单链分子在特定的碱基位点上发生降解并断裂。化学试剂硫酸二甲酯作用鸟嘌呤和腺嘌呤，特异性地断裂嘌呤处的磷酸二酯键，但控制反应的温度和时间，可以选择性地断裂鸟嘌呤而不降解腺嘌呤。化学试剂肼作用胸腺嘧啶和胞嘧啶，但在高浓度盐下，只选择性地破坏胞嘧啶。

与Sanger的双脱氧链终止法相比，Maxam-Gilbert DNA化学修饰法具有以下优点：不需要进行体外酶促反应，而且只要有3'末端标记的或5'末端标记的DNA，不管是双链还是单链，均可以采用此法进行核苷酸序列分析。而对于一种给定的DNA分子和一种可以切割该DNA的核酸内切酶，则可以用Maxam-Gilbert DNA法从限制酶的切割位点开始，按两个相反的取向至少可以测定出250个核苷酸的顺序。另外，采用不同的末端标记法，如3'末端标记或反向的5'末端标记，可以同时测定出彼此互补的两条DNA链的核苷酸顺序，这样便可以互作参照进行核查。不过，如同双脱氧链终止法一样，Maxam-Gilbert DNA法的主要限制因素还是在于序列胶的分辨能力。虽然对于大分子量DNA片段的序列测定而言，化学修饰不如双脱氧链法方便有效，发展速度也没有后者迅速，但至今在相当多的研究工作中仍然被采用。

DNA测序方法-食品生物技术

相关推荐