PCR的模板是含有待扩增序列的DNA或从mRNA反转录的cDNA，这个技术对模板样品要求很低，甚至没有必要对待扩增的模板进行分离纯化即可直接用于反应扩增。1988年，Saiki等成功地将热稳定的Taq DNA聚合酶应用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性，是PCR技术走向实用化的一次突破性进展。一般而言，引物设计的正确与否是PCR扩增成败的关键因素。引物的设计在PCR反应中极为重要。......
2023-11-18
食品生物技术：荧光定量PCR关键方法
【摘要】：荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应分析软件。（一）荧光定量PCR标记方法1.内插染料双链DNA的内插染料是一种能插入双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比。一旦插入双链DNA时，荧光信号将会大幅增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应分析软件。1992年，Higuchi等首次报道，使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度（PCR循环=双链DNA=染料=荧光），后用与双链DNA有更强结合力的SYBR green I取代EB。1996年，Perkin-Elmer公司开发了Taqman探针的荧光定量PCR技术，1996年，Roche公司开发了Fret探针的荧光定量PCR技术，1997年Oncor公司开发了通用引物Molecular Beacon探针的荧光定量PCR技术。
（一）荧光定量PCR标记方法
1.内插染料（SYBR green I）
双链DNA（dsDNA）的内插染料是一种能插入双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比。如SYBR green I染料，当没有结合双链DNA时，只发出相对弱的荧光。一旦插入双链DNA时，荧光信号将会大幅增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。
2.双标记探针（taqman probe）
探针是5'端标记荧光分子（如荧光素），在3'端或在内标记一个吸收或淬灭荧光的分子（如TAMRA），这样5'端激发出的荧光会被3'端的分子淬灭或吸收。所以开始时，仪器并不能检测到荧光。由于Taq聚合酶同时具有5'端外切酶的活性，在PCR反应的延伸阶段，Taq酶会把5'端的荧光分子切下，使其于3'端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器可检测到荧光信号。每个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。(www.chuimin.cn)
3.分子信标（molecular beacon probe）
独特的茎环结构由非特异的茎相特异的环组成，探针的5'端标记荧光分子，3'端标记一个吸收或淬灭荧光的分子。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5'端荧光分子与3'端吸收或淬火荧光的分子分开，仪器可检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。
（二）荧光定量实时分析的优点
荧光定量实时分析主要有以下几点：①全封闭的PCR过程，无须凝胶电泳，无须后处理；②采用dUTP-UNG酶防污染，有效降低污染机会；③实时在线监控，对样品扩增的整个过程进行实时监控、观察产物的增加，直观地看到反应的对数期；④降低反应的非特异性，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性；⑤增加定量的精确性，在样品扩增反应的最佳时段（对数期）进行采集数据，而不是传统的终点法；⑥线性关系直接，到达阈值的循环数和样品的起始模板浓度之间具有线性关系；⑦结果分析更加快捷方便。
有关食品生物技术的文章
- 详细阅读
-
DNA测序方法-食品生物技术详细阅读
DNA测序是DNA分析的一个基本内容。（一）Sanger双脱氧链终止法这个方法是由英国剑桥大学分子生物学实验室的生物化学家Sanger等发明的一种简单快速的DNA测序方法。基本原理是利用DNA聚合酶合成DNA, DNA聚合过程中在特异性的核苷酸位置终止反应而进行测序。那么经过反应后，将会产生出不同长度的DNA片段混合物。最后在放射性X光底片上，直接读出DNA序列。Maxam-Gilbert DNA序列分析法所用的DNA片段，可以是单链也可以是双链。......
2023-11-18
-
荧光光谱分析：定性和定量方法详细阅读
物质所吸收光的波长和发射的荧光波长与物质分子结构有密切关系。利用这些性质对物质进行定性和定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称为荧光分光光度法。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。......
2023-11-04
-
PCR检测技术在食品生物技术中的应用及优势详细阅读
30～40个循环后，对PCR产物进行电泳检测。多重PCR特别适用于检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern杂交同样可靠，且多重PCR尚可检测小片段缺失。应用多重PCR可同时检测多个目的基因的特点，在食品微生物检验、转基因植物的检测中显示了诱人前景。将SSCP用于检查PCR扩增产物的基因突变，从而出现了PCR-SSCP技术，进一步提高了检测突变方法的简便性和灵敏性。通常realtime PCR的实时检测是使用荧光物质来进行的。......
2023-11-18
- 详细阅读
-
食品生物技术：发酵工程与食品工业详细阅读
在食品工业生产中，发酵工业占据重要地位，其既是食品工业的重要构成，又归属国家高新生物技术产业范畴。食品发酵工业是通过采用微生物发酵技术，以农副产品作为原料，研制出可供人们食用及使用的各类发酵制品。据报道，由发酵工程贡献的产品可占食品工业总销售额15%以上，如氨基酸可用作食品、饲料添加剂和药物。目前利用微生物发酵法可以生产近20种氨基酸。......
2023-11-18
-
食品生物技术应用，食品检测详细阅读
现代生物技术在食品安全检测领域中的应用已成为食品科技发展的重中之重。目前生物技术在食品检测中的应用主要有：对食品成分和品质的分析，对农药残留的检测和分析，检测微生物的种类和数量，对转基因食品的检测，对违禁药品的检测。（四）转基因食品检测随着科学技术的发展，以及人们对转基因食品认识程度的不断加深，转基因食品越来越受到人们的关注。所以，转基因食品的利弊还需要进一步的检测。......
2023-11-18
-
植物细胞培养方法及应用-食品生物技术详细阅读
植物细胞培养根据不同的方法可分为不同的类型。目前，原生质体培养在药用植物细胞系的筛选、体细胞杂交和基因工程方面已取得很大进展。（五）植物细胞的悬浮培养这是一种使组织培养物分离成单细胞并不断扩增的方法。它是植物细胞培养技术的应用和发展，中国已建立了紫草、石斛、三叶、青人参、青蒿、红豆杉、西洋参等药用植物细胞悬浮培养体系，其有效成分已达到甚至超过原植株。......
2023-11-18
相关推荐