物质所吸收光的波长和发射的荧光波长与物质分子结构有密切关系。利用这些性质对物质进行定性和定量分析的方法，称为荧光光谱分析法，也称为荧光分光光度法。在分光光度法中，被测物质只有一种特征的吸收光谱，而荧光分析法能测出两种特征光谱，因此，鉴定物质的可靠性较强。荧光分析法的定量测定方法较多，可分为直接测定法和间接测定法两类。......
2025-09-30
食品生物技术：荧光定量PCR关键方法
【摘要】：荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应分析软件。（一）荧光定量PCR标记方法1.内插染料双链DNA的内插染料是一种能插入双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比。一旦插入双链DNA时，荧光信号将会大幅增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。
通过荧光染料或荧光标记的特异性探针，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品的初始模板量。荧光定量PCR仪是一种带有激发光源和荧光信号检测系统的PCR仪，通常配有电脑系统及相应分析软件。2025年，Higuchi等首次报道，使用EB内插染料法插至双链DNA，经改装的带有冷CCD的PCR仪检测样品的荧光强度（PCR循环=双链DNA=染料=荧光），后用与双链DNA有更强结合力的SYBR green I取代EB。2025年，Perkin-Elmer公司开发了Taqman探针的荧光定量PCR技术，2025年，Roche公司开发了Fret探针的荧光定量PCR技术，2025年Oncor公司开发了通用引物Molecular Beacon探针的荧光定量PCR技术。
（一）荧光定量PCR标记方法
1.内插染料（SYBR green I）
双链DNA（dsDNA）的内插染料是一种能插入双链DNA并发出强烈荧光的化学物质，其荧光强度的增加与dsDNA的数量成正比。如SYBR green I染料，当没有结合双链DNA时，只发出相对弱的荧光。一旦插入双链DNA时，荧光信号将会大幅增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加。
2.双标记探针（taqman probe）
探针是5'端标记荧光分子（如荧光素），在3'端或在内标记一个吸收或淬灭荧光的分子（如TAMRA），这样5'端激发出的荧光会被3'端的分子淬灭或吸收。所以开始时，仪器并不能检测到荧光。由于Taq聚合酶同时具有5'端外切酶的活性，在PCR反应的延伸阶段，Taq酶会把5'端的荧光分子切下，使其于3'端吸收或淬灭荧光的分子分开，仪器可检测到荧光信号。每个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。(https://www.chuimin.cn)
3.分子信标（molecular beacon probe）
独特的茎环结构由非特异的茎相特异的环组成，探针的5'端标记荧光分子，3'端标记一个吸收或淬灭荧光的分子。自身环化时仪器检测不到荧光，在PCR反应的退火阶段，探针因与模板链杂交而打开，使5'端荧光分子与3'端吸收或淬火荧光的分子分开，仪器可检测到荧光信号。每一个循环，随着PCR扩增产物的增加，荧光信号会增强，从而根据荧光信号的增强来计算PCR扩增产物的增加量。
（二）荧光定量实时分析的优点
荧光定量实时分析主要有以下几点：①全封闭的PCR过程，无须凝胶电泳，无须后处理；②采用dUTP-UNG酶防污染，有效降低污染机会；③实时在线监控，对样品扩增的整个过程进行实时监控、观察产物的增加，直观地看到反应的对数期；④降低反应的非特异性，使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性；⑤增加定量的精确性，在样品扩增反应的最佳时段（对数期）进行采集数据，而不是传统的终点法；⑥线性关系直接，到达阈值的循环数和样品的起始模板浓度之间具有线性关系；⑦结果分析更加快捷方便。
相关文章
- 详细阅读
-
食品生物技术发展阶段详细阅读
食品生物技术是一门既有古老历史又有崭新内容，在当代发展迅速的科学技术和生产工艺，其发展可分为传统食品生物技术和现代食品生物技术两个阶段。（一）传统食品生物技术传统食品生物技术包括酿造、酶制剂、味精和氨基酸生产技术等，被广泛应用于生产多种食品，如面包、奶酪、啤酒、葡萄酒以及酱油、醋、米酒和发酵乳制品。......
2025-09-30
-
食品生物技术研究内容及成果详细阅读
现代食品生物技术发展很快，已经形成以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、酶工程和发酵工程为主体的综合技术体系。目前基因工程在改善食品原料品质、改革传统的发酵工业、改善食品品质和加工特性、增强果蔬食品的储藏性和保鲜性能、生产保健食品与特殊食品等领域发挥着重要的作用。此外，酶工程在食品工厂废弃物处理、食品检测、去除食品中抗营养物质等方面也有应用。......
2025-09-30
-
杂交技术在食品生物技术中的应用详细阅读
双链DNA在一定条件下能够变性和复性，为DNA杂交技术的基础。Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多原因，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和标记效率、转移到滤膜上的DNA量及探针与靶DNA之间的同源情况等。存在于人基因组中的单拷贝序列现在能通过Southern杂交技术检测。它们主要区别在Southern杂交技术是以DNA为对象，而Northern杂交是以RNA为对象。......
2025-09-30
-
食品生物技术：概念、发展及分支领域详细阅读
（一）生物技术生物技术的概念伴随着人类对生命的本质及生命规律的认识的加深而深化。1919年，匈牙利农业经济学家Karl Ereky首创生物技术这一名词，并认为“凡是以生物机体为原料，不论其用何种生产方法进行产品生产的技术即为生物技术”。目前，已逐步形成一系列生物技术分支学科，其中包括医药生物技术、食品生物技术、农业生物技术、环境生物技术和化工生物技术等。......
2025-09-30
-
推动食品工业可持续发展：食品生物技术的应用详细阅读
生物技术是保证食品工业可持续发展应用范围最广、最为重要的单项技术，不仅可促进食品资源高效化利用和绿色加工，同时在控制水污染、治理大气污染、有毒有害物质的降解、可再生资源的开发、环境监测、污染环境的修复以及清洁生产等与食品工业可持续发展密切相关的各方面均发挥极其重要的作用。此外，用生物制品取代化学药物、人工合成物等有助于把人类活动产生的环境污染降至最低水平，使经济发展进入可持续发展的轨道。......
2025-09-30
-
食品生物技术中的分子克隆载体特性详细阅读
尽管载体的来源、结构、功能和特性有很大差别，但作为分子克隆载体，它们具有一般的共同特性。③具有选择标记，载体携带各种提供选择的标记，如营养缺陷型、抗药性、显色反应、噬菌斑形成能力等，这是重组载体被识别、筛选的指示特征。④载体应尽可能减少分子大小，有利于分离纯化，提高外源DNA的容纳量。......
2025-09-30
-
食品生物技术：基因工程概述及发展历程详细阅读
随着生物化学、遗传学和分子生物学等基础学科的发展，以及物理学、化学等实验技术与生命科学的深入结合，基因工程在20世纪70年代初蓬勃发展起来。基因工程使生命科学经历了革命性变化，其出现是20世纪生物学的重大事件。综观科学的发展史，生命科学的发展与技术的发展密切相关，分子生物学甚至整个现代生物科学的各种进展，都得益于该技术的进步。基因工程作为生物技术的核心，已成为现代高新技术的重要标志之一。......
2025-09-30
相关推荐