PCR技术在食品生物技术中的应用

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：PCR的模板是含有待扩增序列的DNA或从mRNA反转录的cDNA，这个技术对模板样品要求很低，甚至没有必要对待扩增的模板进行分离纯化即可直接用于反应扩增。1988年，Saiki等成功地将热稳定的Taq DNA聚合酶应用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性，是PCR技术走向实用化的一次突破性进展。一般而言，引物设计的正确与否是PCR扩增成败的关键因素。引物的设计在PCR反应中极为重要。

聚合酶链式反应（Polymerase chain reaction, PCR）技术始于20世纪70年代早期，由Khorana与他的同事最先提出，作为一种降低化学合成基因工作量的策略。但当时处于基因序列分析方法尚未成熟，热稳定DNA聚合酶尚未开发以及寡聚核苷酸引物合成还在手工及半自动合成阶段，因此用PCR大量合成基因的想法显得不切实际。所以，Khorana的想法很快就被淡忘。当这项技术用现在的名字被重新出现并付诸实践已是15年以后的事情了。发明人Kary Mullis及他的Cetus公司的同事们，首次报道了用大肠杆菌DNA聚合酶I Klenow片段体外扩增哺乳动物单拷贝基因。即便如此，在热稳定DNA聚合酶尚未发现之前，PCR终究还是一种中看不中用的实验室方法。当嗜热水生菌来源的热稳定DNA聚合酶得到应用后，PCR的效率大幅增加，并趋于自动化。因此，到了20世纪80年代末，PCR已经成为遗传和分子分析的一个最重要的技术。

（一）PCR技术的基本成分

PCR技术高效、快速、敏感且简单易行，原理并不复杂。PCR的成分包括：待扩增的DNA（模板）、一对寡聚核苷酸引物、耐高温的Taq DNA聚合酶、4种脱氧核苷酸的混合物及反应缓冲液。PCR的模板是含有待扩增序列的DNA或从mRNA反转录的cDNA，这个技术对模板样品要求很低，甚至没有必要对待扩增的模板进行分离纯化即可直接用于反应扩增。PCR需要的DNA量也非常少，在一般的实验中，少于100ng的DNA就可作为模板进行PCR，甚至可以扩增单个DNA分子。

1.Taq DNA聚合酶

在早期进行的PCR反应中，是由大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow大片段完成的，但这种酶对热敏感，在双链DNA解链所需的温度条件下会被破坏掉。所以每一轮循环在变性和退火后都需通过人工不断补充新鲜的聚合酶。这样的实验过程不仅操作烦琐费时而且反应低效浪费金钱。此外，Klenow大片段酶的最佳聚合反应温度为37℃，在这样低温条件下，容易促使DNA引物与模板序列之间形成非专一的碱基错配，或易受某些DNA二级结构的影响，使扩增反应混合物产生出非特异性的DNA条带，降低了PCR产物的特异性。

耐高温的Taq DNA聚合酶最初是Erlich于1986年从一种生活在温度高达75℃的热泉中的细菌，即水生嗜热菌（Thermus aquaticus）中分离出来的。它的DNA聚合酶在如此高的温度下能很好的工作，在94℃也能稳定较长时间，在95℃下半衰期长达38min。1988年，Saiki等成功地将热稳定的Taq DNA聚合酶应用于PCR扩增，提高了反应的特异性和敏感性，是PCR技术走向实用化的一次突破性进展。在补加4种脱氧核苷三磷酸（dATP、dGTP、dTTP和dCTP）的反应体系中，Taq DNA聚合酶能以高温变性的靶DNA为模板分别从结合在扩增区段两端的引物为起点，按5'→3'的方向合成新生互补链DNA。这种DNA聚合酶具有耐高温的特性，其最适的活性温度是72℃，连续保温30min仍具有相当高的活性，而只在比较宽的温度范围内保持催化DNA合成的能力，因此，Taq DNA聚合酶只需要在PCR反应开始时加一次就能在整个扩增循环中保持活性，满足PCR反应全过程的需要。这样就可通过编程控制PCR循环仪的反应温度和反应时间，使操作过程完全自动化。

随着Taq DNA聚合酶的发现和使用，PCR的敏感性和特异性也得到了极大提高。如用大肠杆菌DNA聚合酶，在低温下，引物与目的序列退火的特异性不高。在PCR的早期循环中出现不正确的合成片段，将在之后的循环中得到高效扩增。而Taq DNA聚合酶耐热的性质，使得反应中引物与退火温度较高、结合的特异性大大增加，被扩增的片段也能保持很高的正确性。如果使用热启动技术，PCR的特异性可以得到进一步的提高。方法是将样品加热到80℃或更高，然后再加最后一种反应成分，如Taq酶，接着将样品加热到94℃直接开始PCR循环。这样既能提高反应特异性又能提高扩增效率。Taq DNA聚合酶具有类似脱氧核酸末端转移酶的功能，可在新合成双链产物的3'端加上poly（dA）尾，这是一个非模板依赖的碱基合成。利用这种持性可以构建dT-载体克隆带dA尾的产物。

在100μL反应体系中，一般所需Taq DNA聚合酶的用量为0.5～5U，酶浓度过高，可引起非特异性产物的扩增，浓度过低则扩增产物量减少。Taq DNA聚合酶可在-20℃贮存至少6个月。

2.PCR引物

所谓PCR扩增引物，是指与待扩增的靶DNA区段两端序列互补的人工合成的寡聚核苷酸短片段，通常为15～30个核苷酸构成。它包括引物1和引物2，即5'端DNA序列互补的寡聚核苷酸和3'端DNA序列互补的寡聚核苷酸两种。这两种引物在模板DNA上结合点之间的距离决定了扩增片段的长度。实验表明，1kb之内是理想的扩增跨度，2kb左右还是有效扩增跨度，而超过3kb则不能得到有效的扩增，而且较难获得一致的结果。

一般而言，引物设计的正确与否是PCR扩增成败的关键因素。引物如果太短，就可能同非靶序列杂交，而得出非预期的扩增产物。根据概率估算，17个核苷酸所组成的引物平均要在1.5×1010bp上才会有一个结合位点，其长度超过人类基因组DNA总长度的5倍。所以用17个核苷酸的引物对人类基因组进行PCR就有可能获得单一的扩增带，而引物过长往往会降低其与模板的杂交效率，从而降低PCR反应效率。引物的设计在PCR反应中极为重要。

要保证PCR反应准确、特异、有效地对模板进行扩增，引物设计要遵守以下几条原则：①引物碱基G+C含量以45%～55%为宜，G+C太少扩增效果不佳，如太多则易出现非特异条带，ATCG最好是随机分布，以避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列；②引物的长度为15～25个核苷酸；③Tm值高于55℃；④引物扩增跨度以300～500bp为宜，特定的Taq酶可以扩增至10kb的长片段；⑤引物3'端的碱基、特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免末端碱基不配对而导致PCR失败；⑥引物自身配对（特别是引物的3'端）形成的茎环结构，茎的碱基对数不大于3；⑦避免引物内部出现二级结构，引物不能含有自身互补序列，避免两条引物间互补，特别3'端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带；⑧引物的特异性，引物应与核苷酸序列数据库的其他序列物明显有同源性；⑨引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，以便酶切分析或分子克隆。(www.chuimin.cn)

引物贮备液浓度一般为20μmol/L，使用浓度一般为1μmol/L，这一浓度足以完成30个循环的扩增反应。过高，会出现非特异序列扩增及增加引物二聚体的产生且不经济；过低，则PCR的效率低。

在PCR反应中选择引物并非一定要与DNA完全配对，有时需要使用兼并引物，即一类由多种核苷酸组成的混合物，彼此有一个或数个核苷酸的差异。比如，通过氨基酸顺序推测引物，就需要合成兼并引物，兼并引物还可以检测一个已知基因家族的新成员，或检测种间的同源基因。兼并引物PCR过程中容易与模板错配，产生非特异扩增带。因此，常通过调节退火温度避免错配。退火温度高，错配率会降低，但退火温度过高，则影响引物与模板的结合。

3.反应缓冲液

Mg2+可显著影响PCR的产量及产物特异性，一般用量为1.5mmol/L。过高则易出现非特异扩增，过低则酶活性显著下降。明胶、BSA、Tween及DTT对酶有一定的保护作用。Tris-HCl（pH8.3）提供缓冲环境。dATP、dGTP、dCTP和dTTP贮备液浓度均为5mmol/L，保存于-20℃，使用浓度为200μmol/L，过高则反应速度下降，过低则特异性下降。

（二）PCR技术的原理和过程

PCR反应有以下几个关键条件：①变性温度和时间，保证模板DNA解链完全是保证整个PCR扩增成功的关键，一般为94℃90s；②复性温度和时间，PCR反应的特异性取决于复性过程中引物与模板的结合，一般为40～60℃，温度越高、产物的特异性也越高，时间一般为30～60s；③延伸温度和时间，Taq酶最适作用温度为70～75℃，小于1kb的片段一般1～2min就足够，而大片段需延长时间；④循环数，在25～30个循环内，扩增DNA增加明显，以指数方式增加，后进入相对稳定状态，因为，此时引物和dNTP下降，Taq酶活性下降，高浓度的产物可能降低Taq酶的延伸和加工能力，扩增产物（焦磷酸盐和DNA）也有阻碍作用，所以一味增加循环次数只会增加非特异扩增。

通过加热，使双链DNA分子接近沸点温度时分离成两条单链DNA，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物产的4种dNTP（脱氧核苷三磷酸）为原料从该起点开始合成新的DNA互补链。此外，DNA聚合酶也需DNA引物启动或引导新链的合成。待扩增的DNA片段的两条链都可以作为合成新生互补链的模板分别与两对引物配对结合，由于在PCR反应中所选用的引物都是按照与特定扩增区段两端序列彼此互补的原则来设计的，所以新生DNA链的合成都是从引物的退火结合点开始，分别延伸并超过另一条链上的另一个引物的位置，所以新合成的链也有两个引物的合成位点，然后反应混合物经高温变性使新旧两条链分开，作为下一轮反应的模板，低温退火与引物结合，之后在适温下延伸，这三步反应组成一个周期。在适当的条件下，这种循环不断反复，前一个循环的产物可以作为后一个循环的模板DNA参与DNA的合成，使产物DNA的量按指数方式2n扩增。理论上经过30次循环反应，便可使靶DNA即两条引物结合位点之间DNA区段的拷贝数得到109倍的扩增，但实际DNA扩增倍数为106～109。而且只有到了第三循环才开始产生出两条和靶DNA区段完全相同的双链DNA分子（见图2-20），进一步循环才开始产生出靶DNA区段呈指数加倍。最后形成的扩增产物中，原来的DNA链及不同延伸长度的DNA链的比例已可忽略不计。

图2-20　聚合酶链式反应示意图

（a）模板双链DNA分子，反应混合物加热后发生链变性分离；（b）引物结合至待扩增的靶DNA区段两端的配对位点上；（c）Taq聚合酶以单链DNA为模板在引物的引导下利用反应混合物中的dNTP合成互补的新链DNA；（d）将反应混合物再次加热，使旧链和新链DNA变性分离，再一次和引物退火；（e）Taq聚合酶再合成新的DNA片段；（f）大量同样长度的扩增DNA片段。

经过30次循环扩增之后产生靶DNA的量，足以满足任何一种分子生物学研究需要。包括直接的DNA序列的测定和克隆的需要。研究表明，从50μL扩增后的反应混合物中，取5μL样品经琼脂糖凝胶电泳之后，在紫外光下便可观察到清晰的靶DNA条带。即便只含有一个拷贝的靶DNA分子，也能被有效地扩增而检测到，因此，PCR技术能从极微量的样品中通过扩增获得大量的目的DNA片段。正因为PCR技术具有如此高的扩增敏感性，所以其已经成为分子生物学及基因工程中非常有用的实验手段。

PCR技术在食品生物技术中的应用

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