杂交技术在食品生物技术中的应用

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：双链DNA在一定条件下能够变性和复性，为DNA杂交技术的基础。Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多原因，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和标记效率、转移到滤膜上的DNA量及探针与靶DNA之间的同源情况等。存在于人基因组中的单拷贝序列现在能通过Southern杂交技术检测。它们主要区别在Southern杂交技术是以DNA为对象，而Northern杂交是以RNA为对象。

双链DNA在一定条件下能够变性和复性，为DNA杂交技术的基础。DNA杂交技术是分子克隆的核心技术之一，主要有Southern杂交、Northern杂交、Western杂交和菌落原位杂交等。

（一）探针与探针标记

杂交的主要目的是为了检测出同源DNA序列，而为达到这一目的，要有标记的探针。带有能检测的标记物的DNA或RNA称为探针。使DNA或RNA带有可检测的标记物的过程称为探针标记。标记探针的策略多种多样，但最终目的都是用标记的核苷酸代替DNA或RNA上原有的核苷酸。

1.切口平移标记

控制DNase I的浓度，就可在双链DNA分子的一条链的有限位置上打开切口，形成3'-OH末端（这条链即成为引物）和5'-P末端。DNA聚合酶I结合至这个双链DNA的切口处，其5→3的核酸外切酶活性将DNA一条链的核苷酸逐个切除，同时暴露出另一条单链DNA。这条DNA链可以作为合成DNA的模板，DNA聚合酶I的5→3的DNA聚合功能把带有标记物的dNTP逐个加在引物链的3-OH末端，结果使一条DNA的切口从左到右沿着DNA平移，这就叫切口平移（nick translation）（见图2-19）。

图2-19　切口平移示意图

2.随机引物标记

能与任何DNA模板的多个位点配对互补的多个不均一序列寡聚核苷酸DNA片段称为随机引物。DNA聚合酶IKlenow大片段能在随机引物的引导下以带有标记物的dNTP为原料合成新的与模板DNA互补的探针。随机引物标记法优于切口平移标记法，其仅需要一种酶，所以更为简单，而且条件易于控制，同时探针长度较为均一，杂交重复性好。

（二）Southern杂交(www.chuimin.cn)

用标记的DNA或RNA探针对附着于膜上的DNA进行杂交来检测被转移的DNA片段，与探针有同源性的DNA片段在膜上的位置可以通过特定的检测方法如放射自显影或显色而显示。Southern杂交能否检出杂交信号取决于很多原因，包括目的DNA在总DNA中所占的比例、探针的大小和标记效率、转移到滤膜上的DNA量及探针与靶DNA之间的同源情况等。存在于人基因组中的单拷贝序列现在能通过Southern杂交技术检测。

（三）Northern杂交

Northern杂交是相对于Southern杂交而命名。它们主要区别在Southern杂交技术是以DNA为对象，而Northern杂交是以RNA为对象。DNA是双链分子，DNA片段在凝胶电泳分离后，须再用碱处理凝胶变性DNA。RNA一般是单链但其分子中存在二级结构，也必须除去。不过RNA不能用碱处理，因为碱会导致RNA水解。所以在Northern印迹时，一般进行RNA变性电泳，在分离RNA的同时消除RNA中的二级结构，而且保证RNA完全按照分子的大小分离。RNA变性电泳方法主要有3种：甲醛变性电泳、羧甲基汞变性电泳和乙二醛变性电泳，电泳后的转移与Southern转移的方法相同。

（四）Western杂交

Western杂交法以蛋白质为对象。用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，然后将蛋白质从凝胶转移到一种固相支持物上，通过抗体与附着于固相支持物上的靶蛋白所呈现的抗原抗体特异性反应进行检测。该技术广泛用于基因在蛋白质水平上的表达研究。

（五）菌落（噬菌斑）原位杂交

菌落（噬菌斑）原位杂交法是直接以菌落或噬菌斑为对象来检测重组子的技术，它能从成千上万个重组子中迅速检测出与探针序列同源的重组子。由于检测的对象是菌落或噬菌斑，所以转移过程与直接的DNA或RNA转移不同。在含有选择性抗生素的琼脂平板上放一张硝酸纤维素滤膜，将菌点在硝酸纤维素滤膜上倒置平板，于37℃培养至菌落生长到0.5～1.0mm。也可以先在平板上生长细菌再通过影印将菌落转移到硝酸纤维素滤膜上。用0.5mol/L NaOH裂解菌落释放变性的DNA并使DNA结合于硝酸纤维素滤膜上。用Tris-HCl（pH 7.4）中和pH并转移到一张干的滤纸上，置于室温20～30min，使滤膜干燥。将滤膜夹在两张干的滤纸之间，在真空烤箱于80℃烘烤2h，固定DNA。杂交方法同Southern杂交。

杂交技术在食品生物技术中的应用

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