宿主细胞中目的基因表达

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：基因重组的主要目的是要使目的基因在某一种细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的目的基因产物，如多肽、蛋白质类药物。下面着重介绍外源目的基因在原核细胞中的表达。它负责克隆目的基因，指导目的基出在宿主体内的转录和翻译。它使转录在目的基因之后立刻停止，避免作多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量。

基因重组的主要目的是要使目的基因在某一种细胞中能得到高效表达，即产生人们所需要的目的基因产物，如多肽、蛋白质类药物。基因表达是指结构基因在调控序列的作用下转录成mRNA，经加工后在核糖体的协助下又翻译合成蛋白质，再在受体细胞中经修饰而显示出相应的功能。从基因到有功能的产物这整个转录、翻译以及所有加工过程就是基因表达的过程，是在一系列酶和调控序列的共同作用下完成的。

基因表达在原核生物和真核生物中是有区别的，在原核生物系统中，基因表达是以操纵子形式进行的。当操纵子的调节基因与RNA聚合酶作用时，结构基因则开始转录成相应的mRNA，与此同时，mRNA立即与核糖体结合翻译出相应的多肽或蛋白质，转录完毕翻译也完成，随之mRNA被水解；而在真核生物系统中，转录是在核内进行的，先生成hnRNA，再加工去掉内含子，外显子相连接，修饰5'和3'末端形成mRNA。而mRNA只能在细胞质中的核糖体翻译成多肽或蛋白质，再经加工、糖化、形成高级结构。可见整个基因表达过程极其复杂。

最早应用且应用最为普遍的表达体系是原核细胞（主要是大肠杆菌）。下面着重介绍外源目的基因在原核细胞中的表达。

（一）原核基因表达载体的构成

在基因工程中，表达载体扮演着十分重要的角色。它负责克隆目的基因，指导目的基出在宿主体内的转录和翻译。原核表达载体要完成这些功能，必须具备以下3个系统（见图2-18）。

1.DNA复制及重组载体的选择系统

该系统与普通的克隆载体一样，由复制起始位点（ori）和选择性标记基因来完成。复制子是一段包含复制起始位点（ori）和有关序列在内的DNA片段。原核基因表达载体一般是质粒载体，含有能在大肠杆菌中有效复制的复制子。常见的复制子有p15A、CoiEI和pSC101等。在同一大肠杆菌细胞内，含同一类型复制子的不同质粒载体不能共存，但含不同类型复制子的不同质粒载体则可以共存于同一细胞中。如载体还装配有其他生物的ori，则可在不同生物宿主中进行载体DNA复制，这类载体称为穿梭载体。

为从大量的细胞群体中将被转化的重组细胞分离出来，在构建基因表达载体时必须加上选择性标记，使得重组转化体产生新的表型。对于大肠杆菌表达载体来说，一般选择抗生素抗性基因作为选择标记基因，常见的有抗氨苄西林、四环素、氯霉素和链霉素等抗性基因。大肠杆菌表达载体上一般都带有一个以上的抗生素抗性基因。

图2-18　原核基因表达载体的构成示意图

2.外源目的基因的转录系统

该系统包括启动子、抑制物基因和转录终止子。启动子和终止子因宿主的不同而有差别，往往在不同的宿主中表达的效率也不一样，特别是原核生物和真核生物宿主间完全不同，相互间不能通用。

（1）启动子　外源目的基因转录的起始是基因表达的关键。选择可调控的强启动子是构建一个理想表达系统首先要考虑的问题。启动子是一段能被宿主RNA聚合酶特异性识别和结合并指导目的基因转录的DNA序列，是基因表达调控的重要元件。启动子位于基因的上游，其序列长度因生物的种类而异。当RNA聚合酶定位并结合到启动子序列上时，便可启动基因的转录。启动子具有序列特异性、启动的方向性、作用的位点特异性和种属特异性等特征。

（2）抑制物基因　抑制物基因产物是一种控制启动子功能的蛋白质，对启动子的起始转录功能产生抑制作用。适当的诱导条件可使抑制物失活，启动子功能重新恢复。通过抑制物基因产物使目的基因在宿主培养到最佳状态时进行转录，保证转录有效进行，特别是表达产物对宿主有害时，控制转录时机尤其重要。理想的可调控的启动子在细胞生长的初期往往不表达或低水平表达，而当细胞增殖达到一定的密度后，在某种特定的诱导因子（如温度、光和化学药物等）的诱导下，RNA聚合两才开始启动转录，合成mRNA。

（3）转录终止子　是一段终止RNA聚合酶转录的DNA序列。转录启动后，RNA酶沿DNA链移动，持续合成RNA链，直到遇到转录终止信号为止。转录终止子的功能不同于启动子，但它对基因的正常表达有重要意义。它使转录在目的基因之后立刻停止，避免作多余的转录以节省宿主内RNA的合成底物，提高目的基因的转录量。另一方面，正常转录终止子的存在对外源基因的表达同样起着非常重要的作用，它能防止产生不必要的转录产物，有效控制目的基因mRNA的长度，提高mRNA的稳定性，避免质粒上其他基因的异常表达。

3.蛋白质的翻译系统

翻译是mRNA指导多肽链合成的过程，翻译的起始需多种因子协同作用。在原核细胞中影响翻译起始的因素有：起始密码子、核糖体结合位点（SD序列）、起始密码与SD序列之间的距离和碱基组成、mRNA的二级结构、mRNA上游的5'端非翻译序列和蛋白编码区的5'端序列等。蛋白质的翻译系统主要包括：核糖体结合位点（SD序列）、翻译起始密码子和翻译终止密码子。

（二）常见的原核细胞表达载体系统

目前较为广泛应用的原核细胞表达载体系统主要包括以下3种：

1.Plac启动子表达载体系统

Plac表达系统是以大肠杆菌乳糖操纵子调控机制为基础设计和构建的表达系统。大肠杆菌乳糖操纵子的启动子Plac，控制乳糖代谢3种酶基因Z、Y、A的表达，受阻遏蛋白i基因产物I蛋白的负调控，当阻遏蛋白I与乳糖或乳糖的类似物（如异丙基-β-D-硫代半乳糖苷，IPTG）结合时，便发生结构改变，导致对Plac启动子阻遏作用的消失，Plac恢复功能，启动转录，并表达产生控制乳糖代谢的3种酶。

2.PL和PR启动子表达载体系统

PL和PR启动子是大肠杆菌λ噬菌体中控制早期转录的启动子，PL和PR表达载体系统是以该启动子构建的高效表达载体。在野生型λ噬菌体中，PL和PR启动子的转录与否决定λ噬菌体进入裂解循环或溶源循环。λ噬菌体PE启动子控制的CI基因表达产物是PL和PR启动子转录的阻遏物，而CI阻遏物的表达和在细胞中的浓度，取决于宿主与噬菌体因子之间的复杂平衡关系。

3.T7噬菌体启动子表达载体系统

T7噬菌体RNA聚合酶是一种活性很高的聚合酶，能选择性地激活T7噬菌体启动子的转录。其合成mRNA的速率，相当于大肠杆菌RNA聚合酶的5倍。利用大肠杆菌T7噬菌体转录系统元件构建的表达载体系统，具有很高的表达能力。在大肠杆菌宿主细胞中，受T7噬菌体启动子控制的基因，在T7噬菌体RNA聚合酶存在下，能实现高效表达。(www.chuimin.cn)

（三）外源目的基因在原核细胞的表达形式

外源目的基因在原核细胞中的表达形式包括形成包涵体、融合蛋白、寡聚型外源蛋白、整合型外源蛋白、分泌型外源蛋白5种。其表达产物可能存在于细胞质、细胞周质和细胞外培养基中。

1.包涵体

包涵体是外源基因的高表达产物在原核细胞中积累的水不溶性蛋白质结构。包涵体主要由外源基因高表达蛋白产物组成，也含有受体细胞本身的其他表达产物。包涵体具有正确的氨基酸序列，但因其空间构象错误，故一般没有生物学活性。

2.融合蛋白

将外源目的蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组，但不改变两个基因的阅读框，以这种方式表达的蛋白质称为融合蛋白。融合蛋白由位于氨基端的原核蛋白，能被蛋白酶或溴化氰裂解的序列，以及目的蛋白3部分组成。融合蛋白与单独表达的外源蛋白相比具有以下优点：①稳定性较好；②表达效率较高；③较易分离纯化。

3.寡聚型外源蛋白

在构建外源蛋白表达载体时，将多个外源目的蛋白基因串联在一起，克隆在质粒载体上，以这种方式表达的外源蛋白称为寡聚型外源蛋白。不同外源基因以多分子线性重组的方式通常有3种：①多表达单元的重组；②多顺反子重组；③多编码序列重组。

4.整合型外源蛋白

将要表达的外源基因整合至染色体的非必需编码区，使之成为染色体结构的一部分而稳定地遗传，以此种方式表达的外源蛋白即为整合型外源蛋白。实现外源基因与宿主染色体整合是根据DNA同源交换的原理，因此在待整合的外源基因两侧必须分别组合一段与染色体DNA完全同源的序列。此外，还必须将可控的表达元件和选择标记基因连接在一起。

5.分泌型外源蛋白

外源基因的表达产物，通过运输或分泌的方式穿过细胞膜进入培养基中，即为分泌型外源蛋白。在大肠杆菌中的分泌、表达包括翻译和翻译后的运输两个过程。外源基因以分泌型蛋白表达时，需在N端加入由15～30个氮基酸组成的信号肽序列。在信号肽N端的最初几个氨基酸为极性氨基酸，中间和后部为疏水性氨基酸，它们对蛋白质分泌到细胞膜外起决定性作用。当蛋白质分泌到位于大肠杆菌细胞内膜与外膜之间时，信号肽可被信号肽酶所切割。以分泌型蛋白的形式表达外源基因具有以下优点：①可使蛋白质能按适当方式折叠，有利于形成正确的空间构象，获得较好生物学活性或免疫原性的蛋白质；②分泌到细胞外周质的蛋白质产物较稳定，不易被细胞内蛋白酶降解，不含氨基端甲硫氨酸；③简化了发酵后处理的纯化工艺。

（四）在原核细胞中高效表达目的基因

1.高效表达外源基因的基本策略

大肠杆菌表达系统是目前应用最广泛的原核细胞表达系统。在大肠杆菌中高效表达外源基因须采取以下基本策略：

（1）优化表达载体的构建　为了提高外源基因的表达效率，在构建表达载体时，必须着重对决定转录起始的启动子序列和决定mRNA翻译的SD序列进行优化设计。

（2）提高稀有密码子的表达频率　大肠杆菌基因对某些密码子的使用表现了较大的偏爱性，在几个同义密码中往往只有一个或两个被频繁使用。同义密码子的使用与细胞内相应tRNA的丰度呈正相关，稀有密码子的tRNA在细胞内的丰度很低。在mRNA的翻译过程中，往往会由于外源基因中含有过多的稀有密码子而使细胞内稀有密码子的tRNA供不应求，最终使翻译过程终止或发生移码突变。通过点突变等方法，可将外源基因中的稀有密码子，转换为在大肠杆菌细胞中高频出现的同义密码子。

（3）构建基因高表达受体菌　大肠杆菌缺乏复杂的翻译后加工和蛋白质折叠系统，不具备类似真核细胞的亚细胞结构和表达产物稳定因子；大量的异源重组蛋白质在大肠杆菌细胞中形成高浓度微环境，导致蛋白质分子之间的作用增强。这些都是造成重组异源蛋白质在大肠杆菌中不稳定的原因。为了使外源基因高效表达，必须构建适合作为外源基因表达的受体菌株。常用的大肠杆菌基因表达受体菌株有：BL21、HMS174、M5219、RB791等。

（4）提高外源基因表达产物的稳定性　大肠杆菌中含有多种蛋白水解酶，某些外源基因的表达产物会被宿主细胞的蛋白水解酶识别而降解。因此，需采取多种措施提高外源蛋白在大肠杆菌细胞内的稳定性。常用的方法包括：采用分泌型表达系统、构建包涵体表达系统等。

（5）优化工程菌的发酵过程　在进行工业化生产时，工程菌株发酵过程的优化设计和控制，对外源基因的高效表达至关重要。发酵过程的优化主要包括以下几个方面：选择合适的发酵系统或生物反应器；合理设计培养基的营养成分与细胞生长的关系；调节发酵系统中合适的溶氧、pH和温度等条件，控制细胞的生长速度和代谢活动；优化外源基因表达条件，提高菌体浓度和表达水平，从而提高外源基因表达产物的总量。

2.目的基因表达水平的提高与检测

克隆化目的基因表达水平不高的原因可能是RNA不稳定、过早终止、无效翻译及蛋白质不稳定等。若通过脉冲追踪实验确定蛋白质不稳定，则可考虑使用蛋白酶缺陷型菌株或在培养和收获细胞期间使用蛋白酶抑制剂。多数情况下，蛋白质不稳定问题可以通过提高目的蛋白的合成量加以克服。下面提出的几种方法有利于提高目的基因的表达水平即外源目的蛋白的合成水平，如运用定点诱变技术使核糖体结合位点周围的碱基对发生突变、试用不同表达水平的大肠杆菌宿主菌株等方法。

构建含有转录与翻译起始信号和目的基因的重组质粒并导入大肠杆菌表达目的蛋白之后，可用下列方法检测克隆化目的基因的表达水平即目的蛋白的产量，如采用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和放射自显影，检测在诱导前后的重组细胞中目的蛋白的表达量是否提高；通过测定蛋白质的活性以评估活性蛋白的合成产量；利用β-半乳糖苷酶活性进行表达检测。

宿主细胞中目的基因表达

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