筛选与鉴定含目的基因重组体的方法

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：从通过转化或转染获得的细胞群体中选择出含有目的基因的重组体，是基因工程操作中一项十分重要的工作。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落，从而仅需通过目测就可识别并筛选出可能带有重组质粒的转化子菌落。据此，可较易检测出含有重组质粒的菌落，即具外源DNA插入序列的相对分于质量较大的质粒。

从通过转化或转染获得的细胞群体中选择出含有目的基因的重组体，是基因工程操作中一项十分重要的工作。由于目的基因与载体DNA连接时，限制酶切片段是大小不一的混合物，连接的产物除了带有目的基因的重组载体DNA外，还混杂有其他类型的重组载体DNA。此外，在转化（或转导）子群体中还有仅是质粒DNA或染色体DNA转化而成的菌落。因此，必须从群体中分离筛选出带有目的基因的重组体（即特定的目标重组体）。至于采用何种筛选方法更合适，这在很大程度上与所采用的克隆设计方案有关。下面介绍几种最常用的筛选方法。

（一）抗生素抗性基因插入失活法

很多质粒载体都带有1个或多个抗生素抗性基因标记，在这些抗药性基因内有酶的识别位点。当用某种限制酶消化并在此位点插入外源目的DNA时，抗药性基因不再被表达，称为基因插入失活。因此，当此插入外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感，便可筛选出重组转化子（重组体）。

以大肠杆菌质粒pBR322为例（见图2-14），该质粒载体上具有Ampr和Tetr双抗药性标记。当它与外源目的基因重组时，若用BamHI限制酶切割，则外源目的基因插入后，造成Tetr基因失活，转化后的受体细胞（重组菌）不能在含有Tet的培养基上生长，只能在含有Amp的培养基上生长，以此选择Ampr、Tetr的重组细胞（见图2-15）。反之，若在重组时用Pst I酶切割质粒pBR322，则目的基因插入后，Ampr基因失活，转化后可选择Tetr、Ampr的重组细胞。具体方法（以外源基因插入BamH I位点为例）：由于外源基因的插入，使Tetr失活，变为对四环素敏感，但对氨苄西林的抗性并没有失活，故将转化的细胞涂在含有氨苄西林的培养基上，先淘汰大部分非转化子细胞，然后再将在含Amp培养基上生长的菌落（一些含有重组质粒，而另一些只含自身环化的质粒），用无菌牙签挑在含有四环素的培养基上。在此培养基上不能生长的菌落，即为外源基因插入质粒Tetr基因的BamH I位点的重组菌。

图2-14　　pBR322质粒载体

图2-15　抗生素抗性基因插入失活法筛选重组体

（二）β-半乳糖苷酶基因插入失活法

许多载体（如pUC系列）都带有一个来自大肠杆菌的Lac操纵子DNA区段（见图2-16），其中含有β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的头146个氨基酸的编码信息（LacZ）和调控序列（LacI），还插入了一个多克隆位点（但不破坏读框）。这一区段编码β-半乳糖苷酶N端的一个片段（但无酶活性）。而宿主细胞可编码β-半乳糖苷酶C端部分片段（也无酶活性），但两者之间可以实现基因内互补（称为α互补），从而融为一体，形成具有酶活性的蛋白质。由α互补而产生的Lac+细菌在有诱导物异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）和生色底物5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷（X-gal）存在下形成蓝色菌落。

然而，当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，使LacZ的N端片段失活，破坏了α互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落，从而仅需通过目测就可识别并筛选出可能带有重组质粒的转化子菌落。具体操作方法如下：①在含相应抗生素的LB琼脂平板上加入40μL X-gal贮存液（以20mg/mL溶于二甲基甲酰胺中）和4μL IPTG溶液（200mg/mL）；②将溶液均匀涂布于平板表面，置37℃数小时至溶液消失；③将100μL待检细菌悬液涂布于培养基表面，待吸收后倒置于37℃培养12～16h；④将平板在4℃放置数小时以使蓝色充分显现，有LacZ酶活性的菌落外周呈深蓝色，中间淡蓝色，而带有重组质粒的细菌菌落呈白色，挑取白色菌落。(www.chuimin.cn)

图2-16　　pUC18和pUC19质粒载体及其多克隆位点

（三）快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法

重组转化子中，外源目的基因片段已插入质粒载体，即重组质粒的相对分子质量比非重组质粒要大。为了证明重组质粒在相对分子质量上的增加，就要对转化子中重组质粒DNA的大小进行测定，以便筛选出重组转化子。

在快速细胞破碎法中，需配制破碎细胞缓冲液，其中含有十二烷基硫酸钠（SDS）和乙二胺四乙酸（EDTA）。SDS能溶解膜蛋白使细胞破裂，并解聚核蛋白，还能与蛋白质结合成复合物，使蛋白质沉淀；EDTA能螯合金属离子，防止DNAase对DNA的降解作用。细胞破碎后经高速离心，去除细胞碎片和大部分的染色体DNA和RNA蛋白，得到含有质粒DNA的上清液。将上清液（单菌落溶菌物），直接进行点样凝胶电泳和分离测定。在琼脂糖凝胶电泳上分离的各种成分中，有染色体DNA、不同大小的质粒DNA以及RNA，均可肉眼观察或拍照。一个单菌落会有大量的质粒DNA，可在染色体DNA前面形成一条独立的电泳谱带。

质粒DNA的电泳迁移率与其相对分子质量大小成比例。因此，那些带有外源DNA插入序列的相对分子质量较大的重组体DNA，在凝胶中的迁移速度就要比不具有外源DNA插入序列的相对分子质量较小的质粒DNA小。据此，可较易检测出含有重组质粒的菌落，即具外源DNA插入序列的相对分于质量较大的质粒。

快速细胞破碎与凝胶电泳筛选法的操作步骤如下（见图2-17）：①将培养的转化子菌液涂布在已打格编号的抗药性LB平板上（含对照菌）37℃培养16～18h；②用无菌牙签分别刮菌苔到加有50～100μL破碎细胞缓冲液的Eppendorf管中；③各管置37℃水浴中保温15min，于15000r/min离心15min；④吸出各管上清液点样电泳（不加EB）数小时；⑤取出电泳凝胶，浸于含EB的电泳缓冲液中染色15～30min；⑥在紫外灯下观察质粒迁移距离并拍照。

图2-17　快速细胞破碎与凝胶电泳筛选

筛选与鉴定含目的基因重组体的方法

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