食品生物技术使用重组克隆载体引入受体细胞方案

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：带有外源目的DNA的重组分子在体外建成之后，需导入适当的寄主细胞中进行繁殖，才能够获得大量纯的重组DNA分子，这一过程即为基因扩增。只有将携带某一目的基因的重组DNA引入适当的受体（宿主）细胞中，进行增殖并获得表达，才算实现目的基因的克隆。现有的重组克隆载体受体系统主要有大肠杆菌系统、酵母系统、枯草杆菌系统。通过优化各个参数，每微克DNA可以得到109～1010个转化体，是用化学方法制备感受态细胞转化率的10～20倍。

带有外源目的DNA的重组分子在体外建成之后，需导入适当的寄主细胞中进行繁殖，才能够获得大量纯的重组DNA分子，这一过程即为基因扩增。只有将携带某一目的基因的重组DNA引入适当的受体（宿主）细胞中，进行增殖并获得表达，才算实现目的基因的克隆。

（一）基因工程受体细胞

目前，以微生物为受体细胞的基因工程技术最为成熟，在生物制药中已得到广泛应用。现有的重组克隆载体受体系统主要有大肠杆菌系统、酵母系统、枯草杆菌系统。

受体细胞必须具备以下特性：①具有接受外源DNA的能力；②一般为限制酶缺陷型；③一般为DNA重组缺陷型；④不适于在人体内或在非培养条件下生存；⑤其DNA不易转移；⑥重组DNA分子的转化或转染。

（二）重组体DNA分子的转化或转染

重组DNA转化到大肠杆菌细胞中的效率与其感受态有关。感受态就是细菌吸收转化因子（DNA）的生理状态。细菌在低温下经CaCl2溶液处理，细胞膨胀成球形，提高了膜的通透性，转化混合物中的DNA，形成抗DNase的羧基—钙磷酸复合物，粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，使受体细菌中诱导产生一种短暂的感受态。在此期间它们能够摄取各种不同来源的DNA，如λ噬菌体DNA或质粒DNA等。冷冻不仅增加感受态的量，而且可延长感受态的时间。由于感受态细胞的增加从而提高了转化效率。

有两种途径可以得到大肠杆菌感受态细胞的贮存物。第一种是直接向供应商购买贮存的感受态细菌，一般每微克质粒DNA可产生108个以上的转化菌落。这些产品非常可靠但价格昂贵。第二种是在实验室自行制备新鲜的感受态细胞。

下面介绍几种大肠杆菌感受态细胞的制备和重组质粒DNA的转化方法。

1.氯化钙制备新鲜的感受态细胞(www.chuimin.cn)

该方法完全适用于大多数大肠杆菌菌株，并且具有简单快速、重复性好的优点。常用于成批制备感受态细菌，这些细菌可使每微克质粒DNA产生将近107个转化菌落，转化效率足以满足所有在质粒中进行的常规克隆的需要。该法制备的感受态细胞可贮存于-70℃，贮存时间过长会在一定程度上影响转化效率。程序如下：①在一个装有100mL LB培养基的1L锥形瓶中，接入一个受体菌单菌落（37℃平板培养16～20h），置300r/min的旋转式摇床上于37℃振摇培养约3h（活菌数不超过108个/mL）；②将菌液转移到50mL无菌聚丙烯管中，置冰上冷却至0℃；③于4℃以4000r/min离心10min，弃上清液，回收细胞；④于冰浴上以10mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬每份沉淀细胞；⑤同上法离心，弃上清液以回收细胞；⑥每份细胞沉淀（50mL原菌液）以2mL用冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬；⑦从每管中各吸取200μL细胞悬液到微量离心管中，每管加入10μL重组质粒DNA，轻轻旋转混匀，置于冰中30min；⑧将离心管放入42℃水浴，静置1.5min，立即移至冰浴中冷却1～2min；⑨每管加入800μL SOC培养基，置37℃摇床上温育45min，使细菌复苏；⑩取适量已转化的细胞涂布于含有20mmol/L MgSO4和相应抗生素的SOC琼脂平板表面，待液体被吸收后倒置平皿，于37℃培养12～16h后可长出转化菌落。

2.用复合剂制备感受态细胞

该法是使上述大肠杆菌菌株暴露于组合的二价阳离子（MnCl2和CaCl2）中更长时间，并且用氯化六氨合高钴、DMSO、DTT（二硫苏糖醇）等试剂复合处理细菌以提高转化效率，但作用机制尚不清楚。所得到的新鲜感受态细胞可立即用于转化，也可分装成小份贮存于-70℃备用。该方法比较复杂，只有在需要很高转化率的少数情况下才考虑采用，在大多数情况下采用第一种方法已满足要求。

当使用重组DNA分子进行转化时，转化的频率比单纯载体分子一般要下降102～104倍。为了提高转化的频率，必须采取必要的措施，抑制那些不带有外源DNA插入片段的载体分子形成转化于菌落。提高转化频率的措施有：①应用碱性磷酸酶处理法，可以阻止不带有DNA插入片段的载体分子发生自身再环化作用，从而破坏其转化功能；②用环丝氨酸富集法，使那些只带有原来质粒载体的细菌致死，同样也可以达到抑制这些不含有DNA插入片段的载体分子形成转化子（菌落）。该法是依据外源DNA片段的插入作用，导致质检的某种基因失活这一原理建立的。

3.高压电穿孔转化法（电转化法）

该法既可用于将DNA导入真核细胞，也可用于转化细菌。通过优化各个参数（包括电场强度、电脉冲长度和DNA浓度等），每微克DNA可以得到109～1010个转化体，是用化学方法制备感受态细胞转化率的10～20倍。当电场强度和脉冲长度以一定方式组合而使细胞死亡率在50%～75%时，转化效率可达到最高。据报道，线状λ噬菌体DNA的转化效率仅为小质粒超螺旋DNA的0.1%，而质粒的大小对转化效率影响不大。

制备用于电转化法的细胞要比制备感受态细胞容易得多，大致过程是：将培养至对数中期的细菌加以冷却、离心，用低盐缓冲液洗涤并回收细胞。用10%甘油重悬细胞，于冰上速冻后置于-70℃贮存（有效期6个月以上）。进行电转化时，将融解后的细胞悬液与重组质粒DNA混合（20～40μL），移入一个预冷的样品槽内，在0～4℃下用较高的场强进行电转化。

食品生物技术使用重组克隆载体引入受体细胞方案

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