目的基因与质粒载体的体外重组：食品生物技术

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：DNA体外重组是将目的基因用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA。DNA体外重组技术，主要是依赖于限制酶和DNA连接酶的作用。下面主要以目的基因与质粒载体的连接为例。依据外源DNA片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶切位点的性质，可选择采用下列几种方法来进行外源DNA片段与质粒载体的连接。

DNA体外重组是将目的基因（外源DNA片段）用DNA连接酶在体外连接到合适的载体DNA上，这种重新组合的DNA称为重组DNA。

DNA体外重组技术，主要是依赖于限制酶和DNA连接酶的作用。在选择外源DNA同载体分子连接反应的程序时，一般需要考虑下列3个因素：①实验步骤尽可能简单易行；②连接形成的接点序列，应能被某种限制酶重新切割，以便回收插入的外源DNA片段；③对转录和翻译过程中密码结构的阅读应不发生干扰。下面主要以目的基因与质粒载体的连接为例。依据外源DNA（目的基因）片段末端的性质，以及质粒载体与外源DNA上限制酶切位点的性质，可选择采用下列几种方法来进行外源DNA片段与质粒载体的连接。

（一）黏性末端连接法的一般程序

具黏性末端的DNA片段的连接比较容易，也比较常用。一般程序是：选用一种对载体DNA只具唯一限制位点的限制酶（如EcoRⅠ）作位点特异切割，经此酶消化之后就会形成全长的具黏性末端的线性DNA分子，再将外源DNA大片段也用同一种限制酶作同样消化，随后把这两种经过酶切消化的外源DNA和载体DNA混合起来，并加入DNA连接酶，由于它们具有同样的黏性末端，因此便能够退火形成双链结合体。其中的单链缺口经DNA连接酶封闭之后便产生出稳定的杂种DNA分子（见图2-9）。

图2-9　黏性末端连接法示意

（二）定向克隆法

当质粒载体和外源DNA片段用同样的限制酶切割时，所形成的DNA末端能够彼此退火，并被T4连接酶共价连接，形成重组体分子。但由此引导的外源DNA片段的插入，可以有两种彼此相反的取向，不便于基因克隆。当用两种不同的限制酶（如用BamHⅠ和HindⅢ）消化外源DNA时，可以产生带有非互补突出末端的外源DNA片段，此种片段可采用所谓的定向克隆法，即只以一个方向很容易地将其插入到同样用BamHⅠ和HindⅢ消化而产生相匹配黏端的载体（见图2-10）。该法的优点是由于载体片段两突出末端不互补，不能自身环化，因而转化E.coli的效率极低，但与外源DNA片段定向重组率却较高（见图2-11）。

图2-10　质粒载体的定向克隆

图2-11　外源目的DNA片段定向克隆

在制备定向克隆载体时应注意几个问题：①用两种不同限制酶消化后，应通过凝胶电泳或大小排阻凝胶层析纯化载体大片段，以便与切下来的小片段分开；②应尽量避免使用在多克隆位点上彼此直接相邻的限制酶切位点；③必须检查两种限制酶对载体的消化是否完全。

（三）平末端连接法(www.chuimin.cn)

某些限制酶切割后产生平末端的DNA片段，如由mRNA为模板反转录合成的DNA片段具有平末端的结构，PCR扩增也能产生平末端的DNA片段。因此常须进行平末端DNA片段之间的连接。只要两个DNA片段均为平末端，不管是用限制酶切割后产生的，还是用其他方法产生的，都同样可以进行连接，但是只能用T4噬菌体DNA连接酶。虽然T4噬菌体DNA连接酶具有催化平末端DNA片段互相连接这种极为有用的酶学特性，然而，平末端连接为低效反应，连接效率比起带有突出互补末端的DNA低得多，而且重组之后一般不能原位删除。因此，平末端的外源DNA片段与载体连接时，要求具备以下4个条件：①极高浓度的T4噬菌体DNA连接酶；②高浓度的平末端外源DNA和质粒DNA；③低浓度（0.5mmol/L）的ATP；④不存在亚精胺一类的多胺。若在连接反应混合物中加入适量的凝聚剂（如聚乙二醇），可使连接反应在连接酶和DNA浓度不高的条件下进行。这些凝聚剂有两个作用，一是可使平末端DNA的连接速率加大1～3个数量级，二是可以改变连接产物的分布，使DNA分子内连接受到抑制，所形成的连接产物都是分子间连接的产物。

待连接的两种DNA片段中，当一种DNA片段只有平末端，而另一DNA片段具有黏性末端时，无法用DNA连接酶催化连接。或虽然待连接的两种DNA片段都具有黏性末端，但不是互补黏性末端，同样不能用DNA连接酶催化连接。这两种情况下，前者可以先用S1核酸酶除DNA片段的黏性末端，修饰成平末端的片段；后者可以先用S1核酸酶将两种DNA片段都修饰成平末端片段，然后再以平末端连接方法进行连接。

（四）同聚物加尾法

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）的作用底物可以是具3'-OH末端的单链DNA片段，也可以是具3'-OH突出末端的双链DNA片段。如果在反应液中用Co2+代替Mg2+，平末端DNA片段也可以作为底物，而且4种dNTP中任何一种都可以作为反应的前体。在不需要模板链的存在下，TdT就能够将脱氧核苷酸加到DNA分子的3'-OH基团上。当反应物中只存在一种脱氧核苷酸的条件下，便能够构成由同一种类型的核苷酸组成的尾巴。例如，在由带3'-OH单链末端的双链DNA、dATP和TdT组成的反应混合物中，DNA分子的3'-OH末端将会出现单纯由腺嘌呤脱氧核苷酸组成的DNA单链延伸。这样的延伸片段，称为poly（dA）尾。

相反，如果在反应混合物中加入的是dTTP而不是dATP，那么这种DNA分子的3'-OH末端将会形成Poly（dT）尾。Poly（dA）尾同poIy（dT）尾是互补的。因此，任何两条DNA分子，只要分别获得Poly（dA）和Poly（dT）尾，就会彼此连接起来。所加的同聚物尾的长度并没有严格的限制，但一般10～30个残基就已足够。这种连接方法叫作同聚物加尾法。

同聚物加尾法就是利用TdT催化dNTP加到单链或双链DNA 3'-OH端的能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，两者再通过互补同聚物之间的氢键形成可转化大肠杆菌的开环重组分子（见图2-12）。

图2-12　同聚物加尾法克隆双链cDNA

（五）人工接头连接法

人工接头是化学合成的两个自相互补的核苷酸寡聚体（10～12bp），而两个寡聚体可形成带一个或一个以上限制酶切位点的平末端双链寡核苷酸短片段（见图2-13）。人工接头的5'末端先用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，再通过T4 DNA连接酶的作用使人工接头与待克隆的平末端DNA片段连接，接着用适当的限制酶消化DNA分子和克隆载体分子，使二者都产生出彼此互补的黏性末端，这样便可以按照常规的黏性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。

图2-13　三种化学合成的人工接头

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