酶促合成法制取目的基因

目前制取基因工程药物目的基因主要是采用构建基因文库法和酶促合成法，尤其是后一种方法采用得更加普遍。

（一）构建基因文库法分离目的基因

由于目的基因仅占染色体DNA分子总量极其微小的比例，需经过扩增才有可能分离到特定的含有目的基因的DNA片段，故必须先构建基因文库（gene library），或称为DNA文库。

1.构建基因文库法分离目的基因的基本步骤

此法实质上是利用基因工程技术分离目的基因，大致步骤是：①从供体细胞或组织中制备高纯度的染色体基因组DNA；②用合适的限制酶把DNA切割成许多片段；③DNA片段与适当的载体分子在体外重组；④重组载体被引入受体细胞群体中或被包装成重组噬菌体；⑤在培养基上生长繁殖成重组菌落或噬菌斑，即克隆；⑥设法筛选出含有目的基因DNA片段的克隆。

当用上述方法制备的克隆数多到足以把某种生物的全部基因都包含在内时，这一组克隆DNA片段之集合体，就称为该生物的基因文库；在理想的情况下，一个完整的基因文库应该含有染色体基因组DNA的全部序列。有了基因文库，在分离目的基因时就可以从文库中筛选而不必重复地进行全部操作了。

以λ噬菌体为载体构建真核基因组DNA文库的基本步骤（见图2-5）：①用一种或两种限制酶消化λ噬菌体置换型载体，选用适当方法将λ载体左、右臂与中间部位的填充片段分离开；②用一种或几种限制酶部分消化高相对分子质量的真核基因组DNA，再用凝胶电泳或密度梯度离心法分离出适宜长度的DNA片段；③λ噬菌体载体臂与真核DNA片段连接成较长的多联体，随后利用体外包装系统装入λ噬菌体头部，成为有感染力的重组噬菌体；④重组噬菌体通过在大肠杆菌中生长而得以扩增，获得基因组DNA文库。

图2-5　真核基因组DNA文库的构建

2.真核基因组DNA文库的构建过程

一个典型真核基因组DNA文库的构建过程（见图2-6），涉及如下技术问题。

（1）从细胞中分离制备高相对分子质量和高纯度的基因组DNA通常是在有EDTA及SDS一类的去污剂存在下用蛋白酶K消化细胞，使DNA从细胞中释放出来，随后用酚抽提，加RNA酶（RNaseA）去除RNA，低分子量杂质则用透析法去除。这一方法获得的DNA大小适用于在λ噬菌体载体上构建基因组DNA文库。

图2-6　在噬菌体载体ENBL3中制备基因组文库流程

另一种方法是用蛋白酶K消化，用高浓度甲酰胺使DNA-蛋白质复合物解离，通过火棉胶袋透析除去残存的蛋白酶K。该法省去有机溶剂抽提的步骤，故获得的DNA相对分子质量非常大，适于用黏粒载体构建基因组DNA文库所要求的DNA长度。

（2）高分子量基因组DNA的限制酶部分消化　不同的克隆载体接受外源DNA的能力不同，而且也都有一定的限定范围。因此，高相对分子质量的染色体基因组DNA分子，必须先片段化成适于克隆的DNA片段群体。这样的DNA片段群体，既可以通过机械切割，也可以用限制酶消化染色体基因组DNA获得。

（3）含目的基因DNA片段的分部分离与富集　在有些特殊情况下，如事先已经测定了含有目的基因克隆片段的大小，在克隆之前，先对片段化的供体DNA群体进行按大小的分部分离，则会明显提高克隆基因的分离频率。在实验室中，通常是使用琼脂糖凝胶电泳或蔗糖梯度离心进行DNA片段的分部分离。

为了分离某种特定目的基因，而目的基因的全序列又是位于一条DNA片段上，而不是分布在彼此交叠的数种片段上，那么它的序列片段就能够被适当地富集起来。经限制酶消化的基因组DNA片段，通过凝胶电泳或蔗糖梯度离心之后，不同长度的DNA片段便会按大小顺序彼此分开。根据事先已测定的编码目的基因克隆片段的相对分子质量大小，从电泳凝胶的相应谱带上或蔗糖梯度的相应部位，收集DNA片段，便达到富集目的基因DNA片段的要求，克隆这种基因的实验程序就会比较简单快速。

（4）基因组DNA片段与λ载体连接并包装成基因文库　先制备噬菌体载体臂（λ噬菌体的左右端）：以λEMBL3载体DNA为例，经BamHⅠ酶切以释放出中央部分的可置换片段，接着用第二种限制酶EcoRⅠ切去该片段的BamHⅠ黏性末端（14bp片段），使之在后续的连接反应中失活，并用异丙醇沉淀除去14bp片段，使之不与基因组DNA片段竞争连接进入载体臂。在经预试验确定基因组DNA片段与λ载体臂最适比率的基础上使用DNA连接酶，将两者以最适比率连接。连接产物（重组λ噬菌体DNA）再与一种商品包装抽提物混合，在体外进行包装成为重组λ噬菌体（文库）。

（5）从基因文库中分离筛选含有目的基因的重组克隆　对于编码产物是已知的目的基因，可以应用互补的核苷酸序列作探针进行直接分离。这种序列可以从已测序的同源基因获得，或根据纯化的蛋白质产物的氨基酸序列推导。用含有重组噬菌体的包装抽提物铺平板，所产生的噬菌斑可直接采用杂交的方法进行筛选。具体过程是：取一定量已测过滴度的包装混合液（含重组噬菌体）或事先经扩增的文库与一定量用于接种的宿主菌（如LB392细胞）混合，感染吸附并制成LB顶层琼脂，倾于LB琼脂平板上均匀铺开（铺50～100个平板），培养至形成噬菌斑以备筛选。

由基因组文库筛选阳性克隆时，首先将噬菌斑转移到硝酸纤维素薄膜（NC膜）上，吸附在NC膜上的噬菌体DNA经变性、洗涤、干燥等处理，然后再于杂交缓冲液中与放射性探针进行杂交，由膜的放射自显影确定阳性克隆（噬菌斑）位置，从而筛选出含有目的基因DNA的重组噬菌体克隆。

（二）酶促合成法制取目的基因

该法是以某一目的基因的mRNA为模板，用反转录酶先合成其互补DNA（cDNA）的第一链，再酶促合成双链cDNA。这是制取真核生物目的基因常用的方法，也是制取多肽和蛋白质类生物药物目的基因应用最广的一种方法。

1.真核生物细胞中的mRNA(www.chuimin.cn)

酶促合成法的前提是必须首先获得某目的基因对应的mRNA。在哺乳动物中，平均每个细胞约含10-5μg总RNA，每克细胞可分离出5～10mg RNA，但其中的rRNA占80%～85%，tRNA占10%～15%。而mRNA仅占总RNA的1%～5%，而且mRNA分子种类繁多（1万～3万种），核苷酸序列各不相同，大小从数百至数千碱基不等。因此，要从中分离纯化目的mRNA，难度不亚于分离目的基因。绝大多数真核细胞的mRNA分子在其3'端均有一多聚腺苷酸残基组成的尾，可吸附于寡脱氧胸苷酸纤维素上。根据此特性，可用亲和层析法从总RNA中分离纯化mRNA。由此得到的异源性mRNA分子集群的总体，实际上可编码细胞内所有的多肽。

2.从构建的cDNA文库中筛选目的cDNA

以生物体内各种mRNA分子为模板，在反转录酶和其他一系列酶的作用下，合成cDNA分子，并将cDNA与载体DNA进行体外重组，然后去包装转染或转化宿主细胞，得到一群重组DNA的噬菌体或细菌克隆，从而构建成某种生物的cDNA文库，再通过合适的手段从cDNA文库中筛选获取某目的cDNA，也可用于研究生物的基因结构与功能。构建cDNA文库的主要步骤是：

（1）真核细胞总RNA的分离　为了获得高质量的真核细胞总RNA，必须最大限度地降低细胞破碎过程中所释放的内源性RNA酶（RNase）的活性，同时，应避免偶然引入外源性RNA酶对RNA制品的污染。RNA的分离提取方法很多，目前主要采用一步法抽提总RNA。原理是：高浓度强变性剂异硫氰酸胍和β-巯基乙醇能迅速破坏细胞结构，使RNA从细胞中释放出来，同时使细胞内各种RNase失活，保护RNA免于被降解。细胞裂解液通过酚、氯仿等有机溶剂处理，再经离心，使RNA与其他细胞组分（核DNA、蛋白质、细胞残片）分离开来，得到纯化的总RNA。

操作方法：称取新鲜组织100mg，边加液氮边研成粉末状→转入匀浆器中，加入溶液D（内含：异硫氰酸胍、β-硫基乙醇、十二烷基肌氨酸钠、柠檬酸钠）匀浆→转移至离心管、依次加入乙酸钠、酚、氯仿和异戊醇→剧烈振荡，置冰浴于4℃10000g离心20min→吸出上清液，加入异丙醇，-20℃沉淀1～2h→离心弃上清液，沉淀溶于溶液D中→再重复抽提沉淀一次→沉淀用乙醇洗涤、晾干→电泳检测。

（2）mRNA的分离纯化与分析　分离纯化的基本程序如下：①将悬浮于稀碱液的Oligo（dT）-纤维素装入层析柱；②用1×加样缓冲液洗柱至流出液pH＜8.0；③用无菌水溶解RNA，加入等体积的2×加样缓冲液，上柱吸附并收集流出液；④收集的流出液再重新上柱一次，并再收集流出液；⑤用l×加样缓冲液洗柱，分部收集洗出液并测定，直至OD260为0；⑥用洗脱缓冲液洗脱mRNA，分部收集洗脱液并测定OD260；⑦在收集的mRNA中加入乙酸钠溶液和冷乙醇，于4℃离心回收mRNA；⑧用70%乙醇洗涤沉淀，离心并晾干沉淀；⑨用少量水重溶mRNA，加3倍体积乙醇，于-70℃保存备用。

常用Northern杂交（RNA印迹法）测定总RNA或Poly（A）RNA样品中特定mRNA分子的大小和丰度。方法是：将RNA在含有甲醛或含有乙二醛—二甲基亚砜（DMSO）的变性琼脂糖凝胶上进行电泳，使其按分子大小相互分开，随后将变性RNA从凝胶转移至硝酸纤维素滤膜或尼龙膜上。转移方法有毛细洗脱法、真空转移法和电印迹法。由于RNA经过变性处理后能牢固结合于膜上，故可与放射性标记的DNA或RNA探针进行杂交和放射自显影，杂交的敏感度较高，甚至含量仅占总mRNA 0.001%以下的mRNA组分也可迅速地检出并加以定量。

（3）cDNA文库的构建　在λ噬菌体中构建cDNA文库最常用的基本步骤是：

cDNA第一链的酶促合成：合成cDNA第一链是以mRNA为模板，用反转录酶在Oligo（dT）引导下来催化合成反应（见图2-7）。

有两种不同的商品化反转录酶，即禽源和鼠源反转录酶，催化合成cDNA时的最适pH、盐浓度和温度各不相同：禽源为pH 8.3，42℃；鼠源为pH 7.6，37℃。最常用的引物是12～18个核苷酸长的Oligo（dT），反应混合物中可加入大大过量的引物，以使每个mRNA分子结合几个Oligo（dT）分子。通常反应体系中加入一种RNA酶抑制剂，以最大限度减少RNA酶污染而产生的破坏作用。此外，当使用鼠源反转录酶（合成温度较低，37℃）时，在反应前用氢氧化甲基汞处理mRNA，使其二级结构区发生变性，有助于反转录反应的顺利进行。

cDNA第一链的合成程序如下：在灭菌微量离心管中混合下列物质（置于冰上）：mRNA（1mg/mL）10μL；Oligo（dT）（1mg/mL）10μL；1mol/L Tris-HCI（pH 7.6）2.5μL；1mol/L KCl 3.5μL；250mmol/L MgCl22μL；dNTP混合物（各5mmol/L）10μL；0.1 mol/L二硫苏糖醇（DTT）2μL；RNA酶抑制剂25U，加水至总体积为48μL。加入2μL鼠源反转录酶，于4℃混匀之；于37℃温育1h，贮存于4℃。根据小规模反应结果，计算cDNA第一链的合成量（通常接近mRNA质量的50%）。

图2-7　利用Oligo（dT）引物和反转录酶合成cDNA第一链

cDNA第二链的合成：现在构建cDNA文库大多采用置换反应合成cDNA第二链，因为采用该法可直接利用第一链反应产物cDNA：mRNA杂交体，无须进一步处理和纯化，也不必使用S1核酸酶切割单链发夹环，且该反应非常有效。原理是：利用cDNA：mRNA杂交体为切口平移反应的模板，由RNaseH在mRNA链上进行切割而产生一系列RNA引物，再由E.coli DNA聚合酶Ⅰ对这些引物以切口平移反应合成cDNA第二链（见图2-8）。

置换合成法的程序如下：于第一链反应的混合液中直接加入下列试剂后，于16℃温育4h：10mmol/L MgCl 270μL、2mol/L Tris-HCl（pH 7.4）5μL、[α-32P]Dctp 10μL、1 mol/L（NH4）2SO41.5μL、RNA酶H（1000u/mL）1μL、E.coli DNA聚合酶I（1万U/mL）4.5μL；加入下列试剂后，于室温温育15min：50mmol/L NAD 1μL、E.coli DNA连接酶（10×104U/mL）1μL、T4噬菌体多核苷酸激酶（3000U/mL）1μL；加入5μL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）终止反应（吸取小量样品计放射性活度），用等体积酚：氯仿抽提之；通过sepHadexG-50离心柱层析（分离dNTP与cDNA）。用乙醇沉淀洗脱的cDNA，离心回收沉淀的cDNA。

双链cDNA与载体DNA的连接：将双链cDNA连接到质粒载体或λ噬菌体载体的方法有很多种，最主要的有：同聚物加尾法、合成接头或衔接头法（这些方法将在目的基因与克隆载体的体外重组中加以详述）。

λ噬菌体体外包装及感染构建cDNA文库：将重组DNA包装入λ噬菌体并转染适当宿主的方法或重组质粒转化到受体细胞的方法将在重组克隆引入受体细胞一节详细介绍。

目的cDNA克隆的筛选：组建cDNA文库的目的在于分离筛选出对应于各种稀有mRNA的目的cDNA，因此，必须筛选数目大的重组克隆。从cDNA文库筛选目的cDNA的方法通常有下列3种：核酸杂交法；特异性抗原的免疫学检测法；cDNA克隆的同胞选择法。

图2-8　自身引导法合成cDNA第二链

3.RT-PCR法合成目的cDNA

这是近年来发展起来的一种获取真核生物目的cDNA的简便、快捷而高效的酶促合成法。该法将反转录反应与聚合酶链式反应结合，直接从提取的细胞总RNA中酶促合成目的cDNA，已在基因工程中得到广泛应用。

采用反转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）技术合成目的cDNA的一般程序为：①从真核生物组织或细胞中提取纯化总RNA；②在Oligo（dT）的引导下，以总RNA中的总mRNA为模板，在反转录酶的作用下，合成总cDNA的第一链；③以两个引物所结合的单链cDNA（靶序列）为模板，在Taq聚合酶的作用下进行PCR扩增，合成双链目的cDNA。