食品生物技术中的分子克隆载体特性

2023-11-18 理论教育版权反馈

【摘要】：尽管载体的来源、结构、功能和特性有很大差别，但作为分子克隆载体，它们具有一般的共同特性。③具有选择标记，载体携带各种提供选择的标记，如营养缺陷型、抗药性、显色反应、噬菌斑形成能力等，这是重组载体被识别、筛选的指示特征。④载体应尽可能减少分子大小，有利于分离纯化，提高外源DNA的容纳量。

外源基因DNA本身进入细胞的概率极低，在新细胞内不能进行复制和功能表达。这是因为外源基因DNA不带有新细胞的复制系统，不具备在新细胞内有功能表达的调控系统。这样的外源基因DNA随着细胞分裂势必丢失。在分子克隆中，常用运载工具把外源DNA片段导入宿主细胞，使之持续地复制和稳定地表达。这种携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞，并能复制、表达的运载工具称为基因工程载体，简称载体。载体的本质是DNA分子。基因工程所用的载体都是经人工改造过的质粒、噬菌体或病毒DNA分子，它们不但能与外源DNA连接，还能感染宿主细胞，利用载体本身的复制系统使外源DNA在新的宿主细胞内复制，保持稳定存在。

尽管载体的来源、结构、功能和特性有很大差别，但作为分子克隆载体，它们具有一般的共同特性。①在宿主细胞中具有独立复制的能力，载体DNA是单个复制单位，在宿主细胞中可运行复制起始位点，为外源基因在宿主细胞内提供了复制和保持稳定的功能。一般而言，要求载体在宿主细胞中松弛性复制，高拷贝数有利于载体的制备，同时还使外源基因数增加，有利于剂量效应。②含有多种限制性内切酶的单一切点，它们位于载体DNA内不影响复制、生长的非必要区域，在这些切点内允许外源DNA插入，进行连接、重组，减少载体内限制性内切酶酶切位点的数量，只保留单一切点，增加非必要区段酶切位点的种类，这是载体构建早期常遇到的问题。③具有选择标记，载体携带各种提供选择的标记，如营养缺陷型、抗药性、显色反应、噬菌斑形成能力等，这是重组载体被识别、筛选的指示特征。④载体应尽可能减少分子大小，有利于分离纯化，提高外源DNA的容纳量。

目前在基因工程制药中常用的基因克隆载体主要有4类：细菌质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和黏粒。下面加以简单介绍。

（一）质粒

质粒（plasmid）是存在于微生物细胞染色体外的小型闭合环状双链DNA分子，能够进行独立复制并保持恒定遗传的复制子。质粒基因对细菌生长是非必需的，但却能决定细菌的一些重要特性。据此，可以借助质粒使带进细胞的基因表达其遗传信息，改变或修饰寄主菌原有的代谢产物或产生新的物质。因此，细菌质粒是基因工程中主要的克隆载体。

1.质粒DNA的分子特性

质粒不仅在遗传特性方面与寄主染色体不同，而且在分子特性上也有别于寄主染色体，因此，利用这些特性的差异可以对质粒DNA进行分离和检测。

DNA分子有线状与环状两种形式，而环状DNA的双链闭合后，又可以有两种构型：一种是共价闭合环（Covalently Closed Circular，简称CCC）或称闭合环（CC）分子，也称超螺旋（SC）、超卷曲或超线圈的构型，这是具有三级结构扭曲紧张性的分子，从不同属细菌中分离到的所有质粒，似乎都具有共价闭合环状DNA分子。另一种松弛型的分子叫开放环（Open Circular，简称OC）分子。当闭合环一条链的某一处受到切割，和它相对的链上就可自由旋转，分子内的扭曲消除而成为松弛的开放环构型。若质粒DNA经过适当的限制酶切割之后，发生双链断裂而形成线性分子，则称为L构型（见图2-2）。

图2-2　质粒DNA的分子构型

（a）松弛线性的L构型；（b）松弛开环的OC构型；（c）超螺旋的SC构型

ccDNA分子的特性：①呈平面结构的染料会引起质粒ccDNA的形态和沉降常数发生变化；②由于MDNA双链完全紧压闭合成环，插入的染料量与ocDNA或线性L DNA相比要小，密度较大；③ccDNA不易随pH或温度上升而发生双链的解离。

2.质粒DNA的相对分子质量和拷贝数

使用电子显微镜、超离心、琼脂糖凝胶电泳等方法中的一种，分析由氯化铯—溴化乙锭密度梯度平衡离心法制备的ccDNA，以已知相对分子质量的DNA校正，都可测出质粒DNA的相对分子质量。质粒DNA分子的大小一般相当于病毒或线粒体中DNA的大小，而比细菌染色体小得多（大肠杆菌染色体DNA相对分子质量为2.5×109）。按质粒DNA相对分子质量的大小，大致可分为两类：一类是相对分子质量较小的，为（2～5）×106，即3～7kb，一般为非自我传递性；第二类相对分子质量较大，可达（5～10）×107，70～150kb，具有传递能力，并有大小约2×107的tra操纵子结构，占据质粒DNA的大部分。

3.质粒DNA的复制

按质粒复制所受控制的方式和寄主细胞所含质粒拷贝数的多少，可将质粒分为严紧型和松弛型两种复制型。

严紧型指的是质粒DNA复制的启动，受寄主细胞不稳定的复制起始蛋白质控制，它的复制必须在一定的细胞周期内与寄主细胞染色体同步进行，染色体不复制时质粒也不复制，即质粒复制通常是在严紧控制下进行。严紧型质粒在细胞中以低拷贝数存在，每个细胞只有1～2个同样的质粒，如F质粒、pSC101质粒等。松弛型指的是质粒DNA复制的启动，由质粒编码基因合成的功能蛋白质调节，与在寄主细胞周期开始时合成的不稳定复制起始蛋白质无关。在整个细胞周期中质粒均可随时复制，在细胞生长静止期染色体复制已停止时，质粒仍能继续复制，即质粒复制是在松弛控制下进行的。

松弛型质粒在细胞中以高拷贝数存在，每个细胞有10～200个质粒。当用蛋白质合成抑制剂（氯霉素）处理寄主细胞，使染色体DNA复制受阻的情况下，质粒仍可继续扩增，每个细胞的质粒拷贝数可扩增多达数千个。

不同质粒DNA的复制特性，无论在酶学方面还是在机制方面。概括起来主要有如下几点：

（1）复制方向性　已经观察到质粒DNA的复制可以分为纯单向性的（如Col EI）和纯双向性的（如F质粒）两种形式。单向性复制的质粒，是从一个固定的复制起始点开始纯单向性地进行复制，经过一个周期的复制之后，便在起始点处终止复制。双向性复制的质粒，是从一个复制起始点开始纯双向性地进行复制。双向性复制的质粒有两种不同的终止类型：一是待双向生长的复制叉同时到达同一位点时，才发生复制的终止；二是具有一个固定的复制终止位点，但有时是一个复制叉先于另一个复制叉到达复制终止位点。

（2）复制方式　绝大多数已经研究过的质粒复制的方式都是按照蝶状模型进行的，此种复制方式最早于动物病毒中发现。在局部复制的分子中，复制部分的DNA区段双链是解开的，通常按“θ”字母形式进行复制，但未复制部分的DNA，则仍然保持着超螺旋的结构。当复制周期完成时，由于DNA促旋酶作用的结果，在超螺旋的DNA分子中，必定会有一个环被切开。因此，经过了一个复制循环之后，便会产生出一个缺口的分子和一个超螺旋的分子。随后这个缺口的分子也会被封闭而形成超螺旋的结构。

（3）质粒非必要区　典型的质粒包含必要区和非必要区两部分。在必要区中具有与质粒DNA复制有关的基因，它们对质粒的存活及复制功能极为重要；在非必要区里，有直接影响细胞表现，如接合转移、对毒物的抗性等性状的基因存在。

（4）DNA聚合酶的利用　绝大多数大肠杆菌质粒DNA都是利用PolⅢ聚合酶进行链的延长合成，仅在前体片段合成中才利用PolⅠ聚合酶；但另外一些质粒，例如ColE1在它的DNA链的延长合成中，则是利用PolⅠ聚合酶。

（5）对寄主酶的依赖性　有些质粒完全利用寄主细胞所提供的核酸酶进行复制它们自身也编码若干种核酸酶，直接参与DNA的复制。

（二）λ噬菌体载体

1.λ噬菌体的基本特征(www.chuimin.cn)

有侵染力的λ噬菌体的相对分子质量为31×106，是中等大小的温和噬菌体，由一个直径约55nm的正二十面体头部和一条长约150nm、粗约12nm的尾部构成。头部含有一条线状的DNA分子，长度约只有T偶数噬菌体的四分之一（约48kb），包裹在头部外壳蛋白的这条DNA通过尾部被注入细菌细胞。

在λ噬菌体线性双链DNA分子的两端，各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5'单链突出序列，即通常所说的黏性末端（见图2-3）。

图2-3　λ噬菌体线性DNA分子的黏性末端及其环化作用

2.λ噬菌体DNA的复制

线状的λDNA侵入大肠杆菌K12细胞时，首先环合成为环状DNA，两边黏性末端配对，结合形成的缺口由DNA连接酶封闭。λ噬菌体感染寄主细胞之后，λDNA可选择溶源或溶菌两条途径之一。究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这要由CI基因和cro基因编码的蛋白质同λ噬菌体的两个操纵基因（OL, OR）之间的相互作用来决定（见图2-4）。

当进入溶源化途径时，环状λDNA与寄主DNA在附着位点（att位点）上联会、断开、交换并重新接合，结果整个λDNA插入（整合）寄主染色体DNA中，成为原噬菌体DNA，并随着寄主染色体DNA一起复制，此时，只有CI基因得以表达，合成一种可以使参与溶菌周期活动的所有基因失去活性的蛋白质。

图2-4　在溶菌和溶源化周期中λ噬菌体DNA的复制

当进入溶菌途径时，环状λDNA先进行早期双向复制形成子代环状DNA，再进行晚期滚环式复制，形成串连线状λDNA多连体。在包装头部蛋白质外壳时，由剪切酶切割成为单体的子代线状λDNA。在λ噬菌体头部装配上后部成为完整子代，便产生溶菌酶裂解寄主菌而释放出来。

3.λ噬菌体的应用

λ噬菌体载体应用十分广泛，最主要的有：①基因组文库的构建，早期，大容量载体尚未开发时，基因组文库主要以λ噬菌体载体进行克隆；②大容量载体（如YAC、BAC以及cosmid）的基因文库进行筛选时，用置换型的λ噬菌体载体对基因组大片断进行亚克隆；③用插入型或置换型λ噬菌体载体进行cDNA文库的构建；④构建cDNA的表达型重组克隆，采用λZip等载体可以通过T7和SP6 RNA聚合配合成RNA，或使用产生融合蛋白的载体进行免疫筛选。

（三）M13噬菌体载体

1.M13基因组

M13噬菌体含有长度6407个核苷酸的单链DNA基因组。它与fd、fl噬菌体同属丝状噬菌体家族，基因组中5个基因编码衣壳蛋白，围绕（+）DNA装配成丝状噬菌体颗粒。M13（以及fd、f1）只感染大肠杆菌雄性（F'）细菌，不裂解宿主细胞，甚至可以在继续生长和分裂着的宿主细胞中释放出来。

2.DNA复制

感染时，单链DNA基因组转变为复制型（RF）的双链环状结构，以θ型复制。当细胞内RF-DNA达到约200拷贝数时，RF-DNA中（+）DNA被单链特异性的DNA结合蛋白结合，阻断（-）DNA继续复制合成。这时双链的RF型以滚动环方式产生单链子代（+）DNA。结果只能以（-）DNA为模板，不断复制合成新的（+）DNA。M13噬菌体只含有环状单链DNA，但在复制过程中仍以双链DNA为中间体，存在于细胞内。

3.M13载体的应用

M13载体，由于具有RF DNA和单链DNA，主要有以下应用。①用于克隆和分离单链的外源DNA片段。以前，从双链DNA分离出单链是非常复杂的过程，而自从M13载体开发之后，就变得相当简便。只要把外源DNA以两端不同的黏性末端定向地插入一对M13载体，就可以分别合成外源DNA的两条单链DNA。②用于DNA的末端终止法序列测定。③合成32P标记的单链DNA。M13载体的重组DNA与一个特定引物结合，并且有前体32P-a-dNTP存在时，以插入的外源DNA为模板，合成32P标记的单链DNA。此标记的单链DNA可以作为分子杂交探针，对分析真核细胞特定基因的mRNA表达有重要意义。

（四）噬菌粒载体

1.噬菌粒特征

噬菌粒载体是在单链DNA噬菌体基础上，由质粒载体和单链噬菌体复制起始位点结合而形成的一种载体系列。这种载体集质粒和丝状噬菌体载体的有利特性于一身，具有噬菌体和质粒的双重特征，所以称为噬菌体质粒即噬菌粒。

噬菌粒有以下特征：①双链DNA稳定、产量高，具有质粒的特性，基因操作方便；②与M13等单链噬菌体载体相比，噬菌粒分子质量都比较小，大约为3kbp，克隆能力大，容易在体外操作，可用来制备长达10kbp外源DNA的单链或双链DNA等；③应用噬菌粒可直接进行克隆DNA片断的序列测定，省去从质粒到噬菌体这一烦琐又费时的亚克隆步骤。因此，噬菌粒在分子克隆研究中应用广泛。

2.pUC118/119

pUC118和pUC119是比较完善的噬菌粒载体，保留了pUC118/pUC119的优点，增加了M13的复制起始位点、终止位点以及包装必需的序列。与M13丝状噬菌体共感染后，被包装在噬菌体颗粒中。克隆的外源DNA可以像质粒一样复制，形成大量的双链DNA，也可以从感染的宿主细胞中产生单链DNA拷贝。利用此载体可以直接对克隆的DNA片段进行核苷酸序列测定。载体还带有多克隆位点，分子量小，拷贝数高，克隆操作简单。

食品生物技术中的分子克隆载体特性

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