工具酶在食品生物技术中的重要地位

基因工程主要涉及基因操作的反应过程，包括对DNA进行剪切、连接、聚合、水解、修饰等生物化学反应。绝大多数反应是酶催化的，这些酶称为工具酶。因此，工具酶在基因工程技术中占有重要地位。下面介绍几种基因工程中常用的限制性内切酶。

（一）限制性内切核酸酶

1.限制性内切核酸酶的种类

几乎所有种类的原核生物都能产生限制酶。根据结构和功能特性，可将DNA限制性内切核酸酶分为三类，即Ⅰ型酶、Ⅱ型酶和Ⅲ型酶（见表2-1）。Ⅰ型和Ⅲ型限制性内切核酸酶在同一蛋白酶分子中兼有甲基化酶及依赖ATP的限制性内切核酸酶活性，但其识别与切割位点不固定。所以这类酶在基因工程中应用价值不大。而Ⅱ型限制性内切核酸酶因其切割DNA片段活性和甲基化作用是分开的，而且核酸内切作用又具有序列特异性，故在基因克隆中广泛使用。即通常所指的限制性内切核酸酶都是指Ⅱ型酶。限制性内切核酸酶能识别双短DNA中的特异性序列，通过切割双链DNA中每条链上的磷酸二酯酶而消化DNA，有人形象地将它比喻为基因工程的手术刀，是基因工程中不可缺少的工具酶。

表2-1　限制性内切核酸酶的类型

2.限制性内切核酸酶的特征

限制性内切核酸酶具有4个基本特征：

（1）每种酶都有特异的识别序列　限制性内切核酸酶的最大优点就是它们能够在DNA上的相同的位置切割。这个特性是基因分析及其表达等众多技术的基础。不同的限制性内切核酸酶，不仅识别序列不一样，而且识别的碱基数目也不同，识别序列为4、5或6个碱基对。一般来说，识别序列的碱基对越多，则这种酶在DNA上出现的频率越低。不同生物其碱基含量不同，酶识别位点的分布及频率也不同。一些限制性内切核酸酶识别切割序列是4个碱基而不是通常的6个碱基序列，这样就可以在更多的位点切割。因为4个碱基序列的出现频率更高，每44=256个碱基出现一次，而6个碱基长度的序列则是46=4096个碱基出现一次。一些限制性内切核酸酶，如NotⅠ，识别8个碱基序列，所以，其切割频率更小，故称为稀有切割者。

（2）同位酶　即识别相同的序列但切割位点不一样，如SmaⅠ和XmaⅠ识别的序列同为CCCGGG，而切割位置不同，SmaⅠ为CCCGGG, XmaⅠ为CCCGGG同位酶，即识别位点不同但切出的DNA片段具有相同的末端序列。

（3）限制性内切核酸酶识别序列具有180°旋转对称的回文结构　回文结构是指顺看反看都一样的句子。DNA的回文结构也是顺看反看都一样，应注意要从两个方向来读（5'→3'），意味着上面的链必须从左往右读，下面的链从右往左读。切开的DNA末端有平头末端和黏性末端（双链DNA的一条链突出，如5'或3'突出末端），在适当的温度下，两个互补黏性末端能退火形成双链分子，使两个不同的DNA分子之间的缝合更加快速简便。

（4）限制性内切核酸酶HpaⅡ和MspⅠ是同位酶，切割同样的DNA靶子序列CCGG，但对这个序列的甲基化状况有不同的限制性反应MspⅠ切割所有状态下的CCGG序列，不论甲基化还是非甲基化，而HpaⅡ仅切割非甲基化的CCGG四聚体。故MspⅠ被用来识别所有的CCGG序列，从而确定它们是否甲基化。

3.影响限制性内切核酸酶酶切的反应条件

与其他酶反应一样，应用各种限制性内切核酸酶酶切DNA时需要适宜的反应条件。

（1）温度　大部分限制性内切核酸酶最适反应温度为37℃，但也有例外，如Sma I的反应温度为25℃。降低最适反应温度，导致只产生切口，而不是切断双链DNA。

（2）盐离子浓度　不同的限制性内切核酸酶对盐离子强度（Na+）有不同的要求，一般按离子强度不同分为低、中、高3类。Mg2+也是限制性内切核酸酶酶切反应所需。

（3）缓冲体系　限制性内切核酸酶要求有稳定的pH环境，这通常由Tris-HCl缓冲体系来完成。

（4）反应体积和甘油浓度　商品化的限制性内切核酸酶均加50%甘油作为保护剂，一般在-20℃下储藏。在进行酶切反应时，加酶的体积一般不超过总反应的10%，若加酶的体积太大，甘油浓度过高，则会影响酶切反应。

（5）限制性内切核酸酶反应时间　通常为1h。但大多数酶活性可维持很长的时间，进行大量DNA酶解反应时，一般需酶解过夜。

（6）DNA的纯度和结构　一个酶单位定义为在1h内完全酶解1μgλ噬菌体DNA所需的酶量。DNA样品中所含蛋白质，有机溶剂及RNA等杂质均会影响酶切反应的速度和酶切的完全程度，酶切的底物一般是双链DNA, DNA的甲基化位置会影响酶切反应。

（二）DNA聚合酶

DNA聚合酶以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3'-OH端而合成新的DNA。人们已在许多生物中发现了各种不同的DNA聚合酶，这些酶在DNA复制和修复过程中起着重要作用。目前在基因工程中常用的DNA聚合酶是大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及由此酶改造而来的Klenow大片段酶。这里主要说明这两种酶。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是由一条约1000个氨基酸残基的多肽链形成的单一亚基蛋白，分子质量为109Da，具有3种不同的酶活性：①以4种脱氧核苷酸（dATP、dGTP、dCTP和dTTP）为原料，在一定的缓冲液条件下，该酶的5→3聚合酶活性能把这些脱氧核苷酸加到双链DNA分子的3-OH端而合成新的DNA片段；②5→3DNA外切酶活性能从双链DNA一条链的5'末端开始切割降解双螺旋DNA，释放出单核苷酸或寡核苷酸。这种切割活性要求DNA链处于配对状态且5端必须带有磷酸基团；③3→5外切酶活性，即在DNA合成中识别错配的碱基并将它切除。大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ主要用于DNA切口平移中标记DNA探针。

用蛋白酶处理大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ产生两个片段，一个小片段带有5→3DNA外切酶活性，而另一个较大的片段失去了5→3DNA外切酶活性，但保留了另两种活性，即5→3聚合酶活性和3→5外切酶活性，这个大片段被称为Klenow大片段酶。其被广泛用于各种克隆实验中，比如随机引物标记DNA探针和DNA末端标记，末端终止法测定DNA序列，cDNA合成小催化第二链的合成，补平3凹端等。

（三）DNA连接酶

用限制性内切核酸酶切割不同来源的DNA分子，再重组则需另一种酶完成这些杂合分子的连接和封合，这种酶就是DNA连接酶。在双链DNA中，连接酶能催化具有邻近3＇-OH和5＇-P的单链形成磷酸二酯键。因此，该酶可促使具有互补性末端或平头末端的载体和供体DNA片段结合或连接，形成重组DNA分子。在基因工程使用的连接酶主要有大肠杆菌连接酶和T4噬菌体DNA连接酶。这种反应是一种吸能反应，需要提供能量的辅助因子，大肠杆菌连接酶利用NAD+作为能源，而T4噬菌体DNA连接酶则是以ATP作为辅助因子。这两种连接酶都能连接黏性末端和平头末端的DNA分子，但T4 DNA连接酶应用得更广泛。连接反应的效率主要取决于反应混合物中DNA末端的浓度。这些末端可能发生分子间或分子内的相互连接，分别产生寡聚线性或环状连接产物。然而，试验中还是有必要对选择的连接反应条件进行测定，以确认分子环接发生的程度。作为一般规则，在做插入到环状质粒载体上的克隆实验时，载体和要插入的片段越大，连接反应中的DNA浓度就要越小，以有利于最有效的插入和连接。(www.chuimin.cn)

噬菌体基因克隆实验中，一个DNA片段常须插入到两个不同的噬菌体“臂”之间，因而需要3种分子的连接。与质粒克隆载体相比，实验中必须增大DNA浓度。在连接前，用碱性磷酸酶处理载体DNA，以避免首尾相互连接，因而有利于得到含有插入片段的转化子，但并没有改变有利于环接的最佳浓度。对于DNA片段的亚克隆试验，一般插入片段与载体的分子比值为1：1或2：1较合适，这取决于克隆的总体大小，因为供体DNA通常都已经高度富集了所需DNA顺序。

（四）RNA聚合酶

RNA聚合酶是依赖于DNA模板合成RNA的酶。商品化RNA聚合酶的来源主要有3种：①沙门氏菌噬菌体SP6；②大肠杆菌噬菌体T3；③大肠杆菌噬菌体T7。

1.RNA聚合酶一般特性

RNA聚合酶要求含有特定启动子的双链DNA，不需要引物，以其中一条链为模板合成互补的RNA。它们的最小启动子长度为21bp，对其他启动子的亲和性非常低，因此表现出很好的特异性。

合成RNA的聚合反应不需要辅助因子，在体内只对少数基因能进行高效转录。离体条件下，其他基因DNA也可以在这些启动子控制下高效合成RNA，在37℃的反应速率是大肠杆菌RNA聚合酶的10倍左右。

2.3种RNA聚合酶有独特的性能

这3种RNA聚合酶只对它相应的启动子有严格的识别能力。例如，SP6的RNA聚合酶识别双链DNA模板上相应噬菌体特异性的启动子，并沿此双链DNA模板起始RNA的合成。把外源DNA克隆到专门的质粒载体内，并位于SP6启动子的下游。在离体条件下，这个RNA聚合酶可以大量合成与外源DNA中一条链互补的RNA。在一些专用的载体内，改变上游启动子的方向，使外源DNA双链的任一条链作为模板，合成互补的RNA。T3和T7 RNA聚合酶的情况与SP6 RNA聚合酶的情况相似，这两种酶识别双链DNA模板上相应的特异件启动子，沿着双链DNA模板起始RNA的合成。

3.RNA聚合酶的应用

①合成单链RNA，用放射性标记的32P-a-NTP掺入RNA，可作为杂交探针；②合成外源目的基因体外转录产物，作为体外翻译系统中的mRNA或体外剪接反应的底物；③在大肠杆菌、酵母中，用T7转录系统表达克隆化的外源目的基因。

（五）其他工具酶类

1.碱性磷酸酶

碱性磷酸酶催化去除一些底物（包括DNA、RNA和脱氧核糖核苷三磷酸）的5'端磷酸基团。目前有细菌碱性磷酸酶（BAP），它来源于大肠杆菌和小牛肠道碱性磷酸酶（CIP），它是从小牛肠中分离出来的。分子生物学中，常在γ-32P磷酸和多核苷酸激酶在5'端标记DNA或RNA之前，进行碱性磷酸酶处理。在DNA连接之前也常用它处理克隆载体以防止载体自身连接，因而增加了在随后得到重组子的比例，而用于外源DNA片段的末端处理则能有效的避免不同外源片段之间的连接。小牛肠碱性磷酸酶比细菌碱性磷酸酶用得多，因其可在65℃加热45min失活，而细菌碱性磷酸酶则较耐高温，不易失活。小牛肠碱性磷酸酶活性通常比细菌碱性磷酸酶高很多。当第一次用碱性磷酸酶时，通常要检查酶的活性。碱性磷酸酶在pH 8条件下活性很好，可使去除5'端磷酸基的反应与限制性内切核酸酶酶解同时进行。碱性磷酸酶可被无机磷酸强烈抑制。

2.末端脱氧核苷酸转移酶

末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）是从小牛胸腺中分离纯化出来的。它不需要DNA模板，不论是双链DNA还是单链DNA，在一定条件下，能够将脱氧核苷酸，沿着5'→3'的方向逐个加到DNA链的3'-OH末端。该酶在人工黏性末端构建中常使用，因为反应液中只有一种核苷酸时，TdT能在DNA一条链的末端形成寡聚核苷酸同聚物。

3.T4多核苷酸激酶

T4多核苷酸激酶是核酸的一种磷酸化酶，催化底物ATP的γ-磷酸基团转移到DNA或RNA的5-OH基上。在基因工程操作中出现两种反应：①前向反应，用于DNA或RNA 5端的标记反应，催化γ-32P-ATP的γ位32P转移到无磷酸基的DNA 5-OH端。②磷酸交换反应。在底物ATP过量的条件下，DNA的5-P基通过ADP，与ATP的γ位磷酸基进行交换反应。如果底物是γ-32P-ATP，交换反应使DNA或RNA的5端放射性标记。T4多核苷酸激酶主要用于DNA片段的5端标记，特别在DNA化学测序和S1核酸酶分析中广泛用于5端高比强放射性标记。

4.核酸酶

核酸酶是一组成员广泛的核酸水解酶类，底物为核酸（DNA或RNA）。它们对DNA或RNA水解能力有侧重，有外切酶或内切酶。在基因工程中常用的有如下几种：

（1）核酸酶S1　是作用于单链DNA或RNA的一种内切酶。酶切后产生双链DNA和5'-核苷酸。对双链核酸（dsDNA、dsRNA和杂合双链DNA-RNA）不敏感。在基因工程中主要用于3方面：①水解发夹环结构，在双链cDNA合成时打开发夹环；②双链DNA的黏性末端或单链突出，S1酶切后去单链，但不一定能形成很好的平头末端；③用于分析DNA-mRNA杂交体，即S1酶切分析。

（2）DNaseⅠ　来自牛胰，是DNA内切酶，优先从嘧啶核苷酸位置水解双链或单链DNA。在Mg2+存在下，独立作用于每条单链DNA，随机切断DNA。在Mg2+存在时，可以在两条链大致相同的位置切断双链，产生平头或1～2nt突出的DNA片段。DNaseⅠ酶主要用于：①切口平移的DNA标记；②DNaseⅠ足迹法，分析蛋白质与DNA的结合；③截短DNA链。

（3）RNaseA　来自牛胰，是RNA内切酶，优先从嘧啶核苷酸的3'端位置切断RNA，双链中未杂交的RNA片段。

（4）外切核酸酶Ⅲ　催化从双链DNA的3'-OH端内陷或平头末端逐一水解，外切单核苷酸，而对有3'-OH端突出双链DNA没有外切活性。底物为线状双链DNA，或者带有切口、缺口的环状DNA。外切核酸酶Ⅲ还对无嘌呤DNA具有特异性核酸内切酶的活性、RNaseH活性、3'-磷酸酶去3'-P的活性。外切核酸酶Ⅲ主要用于DNA的部分截短，进行标记、定向缺失和定向突变。

（5）RNaseH　是AMV反转录酶和其他某些酶附带的活性。已有从反转录酶中分离纯化的商品酶。RNaseH只对杂合双链DNA-RNA中的RNA进行内切，对双链DNA或RNA都没有作用。RNaseH酶主要应用于cDNA第一链合成后水解除去mRNA。