图20-7基于相关分析的不同种植年限苜蓿草地共生细菌属网络图中不同的节点表示不同的属，节点颜色不同表示分属不同的门，节点的大小表示该属的相对丰度，节点连线的粗细与斯皮尔曼相关系数的值成正比，连线颜色与相关性对应下面以宁夏荒漠草原灰钙土、红黏土和风沙土柠条根际和非根际土壤的细菌群落结构和多样性数据为例，基于相关分析的共生细菌属网络分析见图20-8，网络中的节点属于15个细菌门，共168个节点。......
2023-11-17
基于T-RFLP技术的微生物群落多样性研究结果
【摘要】：在65℃条件下水浴15 min 使限制性内切酶失活，终止消化反应。借助单因素方差分析、Spearman 相关分析等多种统计分析方法对不同再生水干扰强度下各功能区T-RFs 片段丰度变化及细菌群落种属多样性差异进行判别，同时进行T-RFs 类群与环境因子的Spearman 相关分析。
1.3.1 DNA 提取
采用PowerSoil DNA Isolation Kit 12888-50（MOBIO提供）提取植物根际沉积物样品细菌总DNA，操作步骤按照使用说明书进行。提取总DNA 经0.8%（m/V）琼脂糖凝胶电泳分离鉴定，得到的DNA 样品放置于-20℃温度条件下保存、备用。
1.3.2 细菌16S rDNA的PCR扩增
用5'端经6-FAM修饰的引物27f（5'- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和无修饰的1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）对总细菌16S rDNA进行PCR扩增。50μL扩增体系包含4μL DNA 模板，25μL 2×Taq PCR Master Mix，2μL 10 uM 27f 和10 uM 1492r，17μL ddH2O。PCR 扩增程序设置条件为：95℃预变性5 min；95℃变性50 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；最后72℃延伸7 min，4℃保存。荧光PCR 产物采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳检测后，用锡纸密封包裹避光置于4℃保存，以备酶切消化。
1.3.3 末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）分析(www.chuimin.cn)
分别采用限制性内切酶MspⅠ、HhaⅠ和RsaⅠ对16S rDNA PCR 产物酶切。酶切反应体系（20μL）：PCR产物10μl，MspⅠ/ HhaⅠ / RsaⅠ 1μl，10× buffer 2μl，ddH2O 7μl，将体系混匀后，置于恒温培养箱37℃反应4 h。在65℃条件下水浴15 min 使限制性内切酶失活，终止消化反应。随后将酶切产物送至天根生物工程有限公司进行基因扫描（GeneScan），获得T-RFLP 图谱。
1.3.4 数据处理与分析
T-RFLP 谱图用Peak Scanner 进行分析。舍去小于50 bp 的片段。对于细菌，由于相对数量过小的限制性末端片段（T-RFs）不会对群落的特性产生明显的影响[24]，故在本分析中舍去了相对数量＜1%的T-RFs，然后分别计算图谱中每个峰的峰面积与所有峰总面积的比值，将每个T-RF 所占的百分比作为权重导入Primer 软件，实现样点的MDS 排序分析，同时计算细菌群落物种的综合多样性指数（Shannonweaver index）、物种丰富度指数（Margale index）和均匀度指数（Eveness index），对再生水人工湿地净化系统芦苇根际细菌多样性空间差异进行分析。
将MspⅠ、HhaⅠ和RsaⅠ3 种限制性内切酶消化的T-RFLP 图谱属性数据上传到Phylogenetic Assignment Tool（PAT，https：//secure.limnology.wise.edu/trf lp/newuser.jsp）网站，并结合网站MiCA（http：//mica.Ibest.uidaho.edu /pat.php）通过Virtual Digest（ISPaR）模块产生的基础数据库对起主要作用T-RFs类型的系统发育分类进行推测，得到可能对应的种属。借助单因素方差分析（one-way ANOVA）、Spearman 相关分析等多种统计分析方法对不同再生水干扰强度下各功能区T-RFs 片段丰度变化及细菌群落种属多样性差异进行判别，同时进行T-RFs 类群与环境因子的Spearman 相关分析。各类统计方法由Off ice Excel 2007 和SPSS18.0 实现。
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2023-11-17
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2023-11-17
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2023-11-16
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2023-11-07
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2023-11-17
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