NASH患者肠内皮血管中PV1的表达上调，表明GVB在人类NASH的发病机制中也受到损害。这可能有助于解释OCA在NASH患者中的有益作用。F.NASH患者的健康组织或结肠进行PV1染色。该研究较好地将微生物与上皮和肠道血管通透性的增加以及NASH的发展联系起来，并发现①肠道血管屏障的破坏是NASH发病机制的早期事件，也是饮食诱导失调的结果。肠道微生物的重要作用已在临床前NAFLD/NASH模型和NASH患者中明确确立。......
2023-11-16
肠上皮和血管屏障破坏：高脂饮食早期变化
【摘要】：小鼠灌胃LPS后24小时发现ZO-1表达显著降低，表明IEB遭到损伤；48小时后LPS引起内皮细胞PV1表达增加，且呈剂量依赖性，表明内皮细胞暴露于高浓度LPS时GVB受到了破坏。上述结果表明，HFD喂养的早期，导致IEB破坏从而引发细菌易位，随后是GVB遭到破坏。图5-5-1周的HFD喂养足以引起肠道血管屏障的破坏注：A～C.小鼠在取肠前，分别用对照组饮食和HFD喂养48小时。
HFD是一种富含动物饱和脂肪（45%猪油）的饮食，研究表明在C57BL/6小鼠中 HFD可以诱发致胰岛素抵抗、2型糖尿病和NASH的代谢紊乱。研究者首先评估 HFD与对照饮食相比，看是否可以改变IEB和GVB。作为上皮损伤的标志，在喂养后的早期时间点（48小时）分析了紧密连接蛋白ZO-1在HFD小鼠回肠和盲肠固有层中的表达和细菌易位，并与对照组C57BL/6雄性小鼠进行了比较。如图5-5-1A～C所示，在48小时，发现HFD上皮细胞的紧密连接蛋白ZO-1的表达降低（图5-5-1A、B）。HFD中肠上皮细胞相关ZO-1（蓝线）的平均荧光强度比对照喂养的小鼠显著降低（图5-5-1A、B，剖面图），这可能与回肠和盲肠固有层细菌易位增加有关（图5-5-1C）。肠血管屏障遭到破坏的标志物是质膜相关蛋白1（plasmalemmavesicle-associatedprotein-1，PV1），这是一种与内皮横膈膜相关的整合膜蛋白，可通过抗体MECA-32进行标记。研究者发现在48小时，PV1的暴露并没有明显增加（图5-5-1A、B，红线，剖面图）。然而，在HFD开始后1周，通过盲肠和回肠的共聚焦（图5-5-1D）和FACS（图5-5-1E）分析进行评估，ZO-1在肠上皮细胞（EpCAM＋）和CD34＋血管内皮细胞中均下调。此外，在结肠中，尽管与对照组相比没有达到统计学上的显著差异，HFD处理依然导致血管内皮细胞和上皮细胞中ZO-1表达的减少，而其他紧密连接蛋白如occludin、Claudin-3和Claudin-5的表达不受HFD喂养的影响。同时，在HFD喂养的小鼠的回肠和盲肠中发现PV1显著上调（图5-5-1F、G）。在空肠和结肠中观察到类似的情况（图5-5-1F、G）。
上述结果表明HFD处理后引发的一系列连续事件：首先是IEB的破坏，导致细菌或其分子决定簇从管腔中移位，以及随后的GVB损伤。因此，分析了高负荷的病原体相关分子模式是否可以重现观察到的效果。小鼠灌胃LPS后24小时发现ZO-1表达显著降低，表明IEB遭到损伤；48小时后LPS引起内皮细胞PV1表达增加，且呈剂量依赖性，表明内皮细胞暴露于高浓度LPS时GVB受到了破坏。然后，研究者分析了在HFD喂养的后期，当胰岛素抵抗产生时，GVB是否受到损害，以及这是否与肝脏内炎症反应增加有关。为此，给小鼠喂食含有60%脂肪（60%HFD）的饮食，与45%HFD不同，可以在动物模型中诱导炎症反应。此外，在喂食60%HFD持续24周的小鼠中，通过回肠和结肠中的PV-1染色进行评估（图5-5-2A、B）证明GVB被破坏，这与血液中LPS易位的增加有关（图5-5-2C）。NASH的诱导通过肝脏中的脂质堆积（油红O染色，图5-5-2D）、纤维化（胶原纤维的天狼星红染色，图5-5-2D）和血清转氨酶升高（ALT，图5-5-2E）来证实。通过改变对葡萄糖和胰岛素耐量试验的反应（图5-5-2F），发现小鼠也表现出明显的胰岛素抵抗。肝脏中观察到明显的炎症迹象，炎性细胞因子和趋化因子（IFN-γ、IL33和CCL2）（图5-5-2G）和免疫细胞（CD45＋细胞）的增加，特别是CD4＋和CD8＋T细胞、单核细胞和巨噬细胞（图5-5-2H）。上述结果表明，HFD喂养的早期，导致IEB破坏从而引发细菌易位，随后是GVB遭到破坏。GVB的干扰在NASH和炎症驱动的胰岛素抵抗和肥胖症的整个发展过程中保持不变。
图5-5-1 周的HFD喂养足以引起肠道血管屏障的破坏
注：A～C.小鼠在取肠前，分别用对照组饮食（Ctrl）和HFD喂养48小时。（A）回肠和（B）盲肠切片染色CD34（绿色），PV1（红色），ZO-1（渐变）和DAPI（青色）表达，第一行显示合并的图像；第二行仅显示具有梯度的CD34和ZO-1，以及指示荧光强度测量位置的虚线；第三行显示每个标记的强度配置文件。测定回肠和盲肠中的CFU，如C中所示，喂养1周的小鼠（D～G）肠道成像为（D）整块或（F）切片。E.用FACS分析来自盲肠和回肠的细胞悬液中ZO-1的表达。G.对CD34＋区域进行PV1定量。(www.chuimin.cn)
图5-5-2 长期饲喂HFD会导致GVB破坏和肝脏炎症和脂肪变性
注：A～H.小鼠在取肠前，分别用对照组饮食（Ctrl）和HFD喂养24周。A.回肠和结肠切片进行CD34（绿色）、PV1（红色）和 DAPI（蓝色）表达染色。B.对CD34＋区域进行PV1MFI定量。C.测定Ctrl或HFD喂养的小鼠血清中LPS水平。D.肝切片进行H&E，ORO或天狼星红染色分析。E.Ctrl或HFD喂养的小鼠血清ALT浓度。F.空腹和腹腔注射葡萄糖（2g/kg小鼠）和胰岛素（0.2IU/kg小鼠）6小时后进行葡萄糖耐量试验和胰岛素耐量试验。G.通过qPCR分析Ctrl或HFD 喂养的小鼠肝脏中的基因表达。H.FACS染色Ctrl或HFD喂养的小鼠肝脏中的免疫细胞以绝对数表示。
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2023-11-16
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2023-11-16
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