质粒DNA限制酶切及凝胶电泳分离鉴定技术|七号任务

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法，可以快速分辨用其他方法所无法分离的DNA片段。2．DNA分子量标准的制备采用Eco RⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。

【实验目的】

（1）掌握：DNA限制性酶切的实验步骤；琼脂糖凝胶的配制及其电泳的实验步骤；电泳后凝胶染色及条带鉴定的方法。

（2）了解：DNA限制性酶切的原理。

【实验原理】

限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA，如Eco RⅠ识别6个核苷酸序列：5′G↓AATTC3′。限制性内切酶在分子克隆中得到广泛应用，是DNA重组技术的基础。

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法，可以快速分辨用其他方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶（EB）染色时，在紫外光下至少可以检出1～10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作。

【实验器材】

1．10×TBE缓冲溶液（0．89mol／LTris、0．89mol／L硼酸、0．025mol／LEDTA缓冲溶液）：取108g Tris、55g硼酸和9．3g EDTA（EDTANa2·2H2O）溶于水，定容至1000ml，调p H为8．3。作为电泳缓冲溶液时应稀释10倍。

2．6×电泳加样缓冲液：0．25％溴酚蓝、40％（W／V）蔗糖水溶液，贮存于4℃。

3．溴化乙啶（EB）溶液母液：将EB配制成10mg／ml，用铝箔或黑纸包裹容器，储于室温即可。

4．λDNA。

5．重组p UC19质粒。

6．Eco RⅠ酶及其酶切缓冲液。

7．HindⅢ酶及其酶切缓冲液。

8．琼脂糖。

9．仪器：电泳仪、台式高速离心机、恒温水浴锅、微量移液器、微波炉、琼脂糖凝胶成像系统。

【实验内容和方法】

1．DNA酶切反应

（1）用微量移液枪向灭菌的eppendorf管分别加入DNA1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入去离子水，使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液。用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。

（2）混匀反应体系后，将eppendorf管置于适当的支持物上（如插在泡沫塑料板上），在37℃水浴中保温2～3h，使酶切反应完全。

（3）每管加入2μl0．1mol／LEDTA（p H8．0），混匀，以停止反应，置于冰箱中保存备用。(www.chuimin.cn)

2．DNA分子量标准的制备采用Eco RⅠ或HindⅢ酶解所得的λDNA片段来作为电泳时的分子量标准。λDNA为长度约50kb的双链DNA分子，其商品溶液浓度为0．5mg／ml，酶解反应操作见上文。HindⅢ切割DNA后得到8个片段，长度分别为23．1、9．4、6．6、4．4、2．3、2．0、0．56和0．12kb。Eco RⅠ切割1DNA后得到6个片段，长度分别为21．2、7．4、5．8、5．6、4．9和2．5kb。

3．琼脂糖凝胶的制备

（1）取10×TBE缓冲液20ml加水至200ml，配制成1×TBE稀释缓冲液，待用。

（2）胶液的制备：称取0．4g琼脂糖，置于200ml锥形瓶中，加入50ml0．5×TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为0．8％琼脂糖凝胶液。

（3）胶板的制备：将有机玻璃胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。向冷却至50～60℃的琼脂糖胶液中加入溴化乙啶溶液其终浓度为0．5μg／ml（也可不把溴化乙啶加入凝胶中，而是电泳后再用0．5μg／ml的溴化乙啶溶液浸泡染色）。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封有机玻璃胶槽两端内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。倒胶时的温度不可太低，否则凝固不均匀；速度也不可太快，否则容易出现气泡。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入0．5×TBE稀释缓冲液，至液面恰好没过胶板上表面。

（4）加样：取10μl酶解液与2μl6×加样缓冲液混匀，用微量移液枪小心地加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换枪头，以防止互相污染。注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

（5）电泳：加完样后，接通电源。控制电压保持在60～80V，电流在40m A以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。

（6）染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0．5μg／ml的EB溶液中，室温下染色20～25min。

（7）观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外线灯下观察染色后的或已加有溴化乙啶的电泳胶板。DNA存在处显示出肉眼可辨的荧光条带。

【注意事项】

（1）酶切时所加的DNA溶液体积不能太大，否则DNA溶液中其他成分会干扰酶反应。

（2）酶活力通常用酶单位（U）表示，酶单位的定义是：在最适反应条件下，1小时完全降解1μgλDNA的酶量为一个单位。但是许多实验制备的DNA不像λDNA那样易于降解，需适当增加酶的使用量。反应液中加入过量的酶是不合适的，除考虑成本外，酶液中的微量杂质可能干扰随后的反应。

（3）市场销售的酶一般浓度很大，为节约起见，使用时可事先用酶反应缓冲液（1×）进行稀释。另外，酶通常保存在50％的甘油中，实验中，应将反应液中甘油浓度控制在1／10之下，否则，酶的活性将受影响。

（4）观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间，并采用长波长紫外线灯（300～360nm），以减少紫外光切割DNA。

（5）溴化乙啶是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把溴化乙啶洒到桌面或地面上。凡是沾污了溴化乙啶的容器或物品必须经专门处理后才能清洗或丢弃。

（6）当溴化乙啶太多、胶染色过深、DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水中冲泡，30min后再观察。

【想一想】

（1）琼脂糖凝胶电泳中DNA分子迁移率受哪些因素影响？

（2）如果一个DNA酶解液在电泳后发现DNA未被切，你认为可能是什么原因？

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