SDS-PAGE蛋白质分子量测定实验指导

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：用来溶解标准蛋白质及待测固体。根据样品蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出其分子量。用SDS凝胶电泳法测定分子量时，每次测量样品都必须同时作标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

【实验目的】

（1）掌握：SDS聚丙烯酰胺凝胶配制和电泳的基本步骤；SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离测定蛋白质分子量的实验方法。

（2）了解：SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理。

【实验原理】

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）利用聚丙烯酰胺网状结构，具有分子筛效应的功能，常用于分离蛋白质。SDS是十二烷基硫酸钠（sodiumdodecylsulfate）的英文缩略词，它是一种阴离子表面活性剂，加入到电泳系统中能使蛋白质的氢键、疏水键打开，并结合到蛋白质分子上（在一定条件下，大多数蛋白质与SDS的结合比为1．4g SDS／1g蛋白质），使各种蛋白质 SDS复合物都带上相同密度的负电荷，其数量远远超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而掩盖了不同种类蛋白质原有的电荷差别。这样就使电泳迁移率只取决于分子大小这一因素，于是根据标准蛋白质分子量的对数和迁移率所作的标准曲线，可求得未知物的分子量。

【实验器材】

（1）30％分离胶贮存液：30g丙烯酰胺，0．8g Bis，用无离子水溶解后定容至100ml，不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。

（2）10％浓缩胶贮存液：10g丙烯酰胺，0．5g Bis，用无离子水溶解后定容至100ml，不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。

（3）分离胶缓冲液（Tris HCl缓冲液 p H8．9）：取1mol／L盐酸48ml，Tris36．3g，用无离子水溶解后定容至100ml。

（4）浓缩胶缓冲液（Tris HCl缓冲液 p H6．7）：取1mol／L盐酸48ml，Tris5．98g，用无离子水溶解后定容至100ml。

（5）电泳缓冲液（Tris甘氨酸缓冲液 p H8．3）：称取Tris6．0g、甘氨酸28．8g、SDS1．0g，用无离子水溶解后定容至1L。

（6）样品溶解液：取SDS100mg，巯基乙醇0．1ml，甘油1ml，溴酚蓝2mg，0．2mol／L p H7．2磷酸缓冲液0．5ml，加重蒸水至10ml（遇液体样品，浓度增加一倍配制）。用来溶解标准蛋白质及待测固体。

（7）染色液：0．25g考马斯亮蓝R 250，加入454ml50％甲醇溶液和46ml冰乙酸即可。

（8）脱色液：75ml冰乙酸、875ml水与50ml甲醇混匀。

（9）10％过硫酸铵溶液，10％SDS溶液，1％TEMED。

（10）标准蛋白质：溶菌酶（Mr14300）、胃蛋白酶（Mr35000）、血清白蛋白（Mr 67000）等。按每种蛋白0．5～1mg／ml配制。可配成单一蛋白质标准液，也可配成混合蛋白质标准液。

（11）DYCZ24D型垂直板电泳槽。

（12）100ml烧杯。

（13）微量移液器2～20μl，100～1000μl。

【实验内容和方法】

1．安装垂直板电泳槽

（1）将密封用硅胶框放在平玻璃上，然后将凹型玻璃与平玻璃重叠。(www.chuimin.cn)

（2）用手将两块玻璃板夹住放入电泳槽内，玻璃凹面朝外，插入斜插板。

（3）用蒸馏水试验封口处是否漏水。

2．制备凝胶板

（1）分离胶制备：取分离胶贮存液5．0ml、Tris HCl缓冲液（p H8．9）2．5ml、10％SDS 0．20ml、去离子水10．20ml、1％TEMED2．00ml置于小烧杯中混匀，再加入10％0．1ml过硫酸铵，用磁力搅拌器充分混匀2min。混合后的凝胶溶液，用细长头的吸管加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用吸管在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水（3～4cm），用于隔绝空气，使胶面平整。分离胶凝固后，可看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限。倒掉重蒸水，用滤纸吸去多余的水。

（2）浓缩胶制备：取浓缩胶贮存液3．0ml、Tris HCl缓冲液（p H6．7）1．25ml、1％TEMED2．00ml、4．60ml去离子水、10％过硫酸铵0．05ml，用磁力搅拌器充分混匀。混合均匀后用细长头的吸管将凝胶溶液加到长短玻璃板的窄缝内（及分离胶上方），距短玻璃板上缘0．5cm处，轻轻加入样品槽模板。待浓缩胶凝固后，轻轻取出样品模槽板，用手夹住两块玻璃板，上提斜插板，使其松开，然后取下玻璃胶室，去掉密封用胶框，用1％电泳缓冲液琼脂胶密封底部，再将玻璃胶室凹面朝里置入电泳槽。插入斜插板，将电泳缓冲液加至内槽玻璃凹口以上，将外槽缓冲液加到距平玻璃上沿3mm处。

3．样品处理各标准蛋白质及待测蛋白质都用样品溶解液溶解，使浓度为0．5mg／ml，在沸水浴加热3min，冷却至室温备用。处理好的样品液若经长期存放，使用前应在沸水浴中加热1min，以消除亚稳态聚合。

4．加样一般加样体积为10～15μl（即2～10μg蛋白质）。如果样品较稀，可增加加样体积。用微量注射器小心地将样品通过缓冲液加到凝胶凹形样品槽底部，待所有凹形样品槽内都加了样品，即可开始电泳。

5．电泳将直流稳压电泳仪开关打开，开始时将电流调至10m A，待样品进入分离胶时，将电流调至20～30m A。当蓝色染料迁移至底部时，将电流调回到零，关闭电源。拔掉固定板，取出玻璃板，用刀片轻轻将一块玻璃撬开移去，在胶板一端切除一角作为标记，将胶板移至大培养皿中染色。

6．染色及脱色将染色液倒入培养皿中，染色1h左右，用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰，即可计算相对迁移率（图2-13-4）。

图2-13-4 标准蛋白质在SDS凝胶上的示意图

7．结果处理测量由点样孔至溴酚蓝及蛋白质带的距离（mm），计算相对迁移率（Rf）。公式如下：

Rf＝样品移动距离（mm）／溴酚蓝移动距离（mm）

以标准蛋白质分子量的对数做纵坐标，相对迁移率做横坐标制作标准曲线。根据样品蛋白质的相对迁移率从标准曲线上查出其分子量。

【注意事项】

（1）用SDS凝胶电泳法测定分子量时，每次测量样品都必须同时作标准曲线，而不得利用另一次电泳的标准曲线。

（2）因SDS可吸附考马斯亮蓝染料，染色前先用脱色液浸泡凝胶，洗去SDS。可使染色及脱色时间缩短，并使蛋白质带染色而背景不染色。

（3）若样品为水溶液，则需将样品溶解液的浓度提高一倍，然后与等体积样品溶液混合。