凝胶柱层析分离鉴定蛋白质实验指导

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：掌握凝胶柱层析分离技术的原理。利用交联葡聚糖凝胶G 50的凝胶过滤作用，将脲酶和胰岛素分开，以FolimDenis反应检查流出液中的蛋白质。将乳胶管放下，仍继续加入上述悬液至凝胶层沉积至18cm高度即可。操作过程中，应防止气泡与分层现象的发生。某样品中含有1mg A蛋白、1mg B蛋白、4mg C蛋白、1mg D蛋白、1mg E蛋白，采用Sephadex G75凝胶柱层析，请指出各蛋白质的洗脱顺序。通过实验讨论，哪些因素会影响凝胶层析的分离效果？

【实验目的】

（1）掌握凝胶柱层析分离技术的原理。

（2）熟悉层析技术的操作。

【实验原理】

利用交联葡聚糖凝胶G 50的凝胶过滤作用，将脲酶（MW48000）和胰岛素（MW5700）分开，以FolimDenis反应检查流出液中的蛋白质。此反应主要靠蛋白质中的酪氨酸和色氨酸与含磷钼钨酸的酚试剂生成蓝色钼蓝Mo3O6（2Mo O3Mo O2），蓝色深浅与蛋白质含量成正比关系。以纳氏（Nessler）试剂检查脲酶活性，此反应是先将脲酶流出液分解尿素产生氨，而氨可与纳氏试剂作用生成黄色的碘代双汞胺。反应式如下：

NH3＋2（KI）2HgI2＋3Na OH → Hg2NH2I2＋3Na I＋4KI＋2H2O

碘代双汞胺

【实验器材和用品】

交联葡聚糖凝胶G 50、层析柱、小烧杯2只、滴管2支、橡皮筋和回形针各1根、试管30支、洗耳球1个、试管架1个、脲酶试剂［称取脲酶（BR）400mg用0．9％Na Cl为溶剂配制100ml，置冰箱中保存］、脲酶与胰岛素混合液［取脲酶液10ml加胰岛素注射液（40U／ml）1ml混匀］、饱和Na2CO3溶液、0．5％尿素溶液、市售酚试剂、纳氏试剂、蒸馏水。

【实验内容和方法】

（1）取直径0．8～1．2cm，长度为25cm的层析柱，在上口箍橡皮筋，出口处装上乳胶管，柱内加注蒸馏水2～3ml，排出乳胶管内的气泡，抬高乳胶管防止柱内的蒸馏水排空。自顶部缓缓加入经膨胀的葡聚糖G 50悬液。将乳胶管放下，仍继续加入上述悬液至凝胶层沉积至18cm高度即可。操作过程中，应防止气泡与分层现象的发生。让凝胶自然下沉，使表层平整。待凝胶柱层稳定后，以洗脱液（蒸馏水）洗柱5min，调节流速至12～15滴／min。

（2）取15mm×100mm试管20支，分成A、B两组：A组编号A1～A10，B组编号B1～B10。

（3）加样与洗脱：放下乳胶管，使蒸馏水流出，待液面与凝胶表层平齐时，抬高乳胶管（不可使凝胶表层干裂）。用长滴管吸取脲酶与胰岛素的混合液12滴，尽量接近凝胶面缓缓加入，勿使凝胶面搅动。放下乳胶管，同时开始用A组试管分段收集。待样品完全进入凝胶层内，液面与凝胶表层平齐时，用上法加蒸馏水约1ml（蒸馏水不可多，防止样品稀释）。当此少量的蒸馏水液面与凝胶表层平齐时，再加入多量的蒸馏水洗脱。在A组每管收集2ml，混匀后分别吸取0．5ml于相应管号的B组试管中。如此收集10管，然后再继续洗脱约15ml，以清洗分离柱。抬高乳胶管，防止层析柱内凝胶干裂，柱内加满水（保存备用）。

（4）B组每管加2滴饱和Na2CO3溶液，混匀，然后逐管加酚试剂2滴（随加随摇），稍后观察蓝色的深浅，判断蛋白质含量。取试管，将B组第一个峰所对应各A管中的溶液再吸出0．5ml，编号C组。在C组每管中各加0．5％脲液1ml，混匀，置40℃水浴中保温15min，取出稍冷，逐管各加纳氏试剂2滴（随加随摇），稍后观察黄色的深浅，检查NH3含量，比较脲酶活性。(www.chuimin.cn)

（5）将层析柱内的凝胶回收入凝胶瓶内。

（6）用肉眼观察A组和B组各管颜色的深浅，以“－、±、＋、＋＋”等表示，并以此为纵坐标，管号为横坐标作图。

【注意事项】

（1）在收集过程中，要保持流出液的流速稳定。

（2）加样时，保持凝胶平面不被搅动。

（3）液面要始终高于凝胶平面，否则会导致干柱。

（4）为防止试管内有重金属离子，在实验前用0．1％EDTA二钠浸泡5min，然后用自来水冲洗，再用蒸馏水少许洗一次。

【想一想】

（1）在向凝胶柱中加入样品时，为什么必须保持胶面平整？上样体积为什么不能太大？（2）请解释为什么在洗脱样品时流速不能太快或太慢？

（3）某样品中含有1mg A蛋白（MW10000）、1mg B蛋白（MW30000）、4mg C蛋白（MW60000）、1mg D蛋白（MW90000）、1mg E蛋白（MW120000），采用Sephadex G75（排阻上下限为MW3000～70000）凝胶柱层析，请指出各蛋白质的洗脱顺序。

（4）还有哪些方法可进行蛋白质脱盐？

（5）通过实验讨论，哪些因素会影响凝胶层析的分离效果？