鼠肝DNA制备：苯酚氯仿提取法简介

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：真核生物中，DNA主要存在于细胞核中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。要从生物组织中提取DNA，因DNA以DNP形式存在于细胞核中，故首先必须粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白质。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。

【实验目的】

（1）掌握：有机溶剂法DNA提取技术的原理；DNA定性及定量分析的原理。

（2）熟悉：DNA提取的操作；DNA定性及定量分析的操作。

【实验原理】

DNA是储存遗传信息的物质，是遗传的物质基础，它与生命的正常活动如种属遗传、生长发育有密切关系。其结构与功能的研究是当前分子生物学研究的主要内容之一。

核酸广泛存在于生物中，DNA含有生物体的全部遗传信息，在生物组织中以核蛋白（DNP）形式存在。真核生物中，DNA主要存在于细胞核中，核外也有少量，如线粒体DNA，称为核外基因。DNA的分子长度一般随生物由低级进化到高级而增加。人类基因组含2．9× 109bp。

无论是研究核酸的结构，还是它的功能，首先需要对核酸进行分离与提纯。分离与提纯核酸最基本的要求是保持核酸的完整性及纯度。

要从生物组织中提取DNA，因DNA以DNP形式存在于细胞核中，故首先必须粉碎组织，裂解细胞膜和核膜，使DNP释放出来，再用苯酚提取蛋白质。由于细胞中的核糖核蛋白（RNP）和DNP往往一起被提取，故DNA沉淀中混有RNA，需用核糖核酸酶（RNase）处理，去除RNA，并用蛋白酶将遗留的少量蛋白质水解除去，再经苯酚处理，乙醇沉淀，最后可得到较纯净的DNA。它的纯度可以从260nm波长处的光密度和280nm波长处的光密度之比值测知，一般以O．D260nm／O．D280nm能达到1．8左右为标准。

分离与提纯过程中保持DNA的完整性和纯度存在许多困难，主要原因有：①细胞内存在很高的DNA酶活性，在分离与提纯过程中会造成核酸的降解。②DNA分子很大，分离过程中因化学因素或物理因素使DNA降解，如强酸、强碱、温度过高或机械张力剪切等。DNA的定量可采用化学的定磷法、定核酸法。目前多数实验室采用紫外分光光度法测定核酸含量，以下公式可作为紫外定量时的参考：

双链DNA含量： O．D260nm×样品稀释倍数×50μg／ml＝ μg／m1样品。

【实验器材】

（1）塑料离心管6支。

（2）刻度离心管1支。

（3）滴管：长管1支吸酚、氯仿混合液，中管1支吸乙醇，短（钝口）管1支吸DNA水溶液。

（4）细玻棒1根。

（5）移液管1支。

（6）微量取样器1个。

（7）手套1副。

（8）离心机1台。

（9）紫外分光光度计1个。

（10）37℃水浴、50℃水浴。

（11）组织捣碎器1台。

（12）电泳仪及电泳槽1组。

（13）裂解缓冲液：50mmol／LTris HCl，p H7．80；20mmol／LEDTA；0．5％十二烷基硫酸钠（SDS）；0．1mol／LNa Cl（1mol／LTris HCl50mlp H7．8，20％SDS25ml，2mol／LNa Cl 50ml，0．5mol／LEDTA40ml，蒸馏水稀释至1000ml）。其中，Tris HClp H7．8，维持p H恒定，防止DNA变性和水解；EDTA能络合二价金属离子，当Mg2＋被络合后，细胞内释放出来的DNA酶的作用被抑制，以避免DNA的降解，同时金属离子络合后，细胞膜的稳定性下降，有利于膜的裂解；SDS有使蛋白质变性的作用，它能破坏膜蛋白的构象，因此使膜裂解，它又能使核蛋白中的核酸与蛋白质解离，并且SDS也具有抑制DNA酶的作用。

（14）苯酚：重蒸苯酚加入抗氧化剂8羟喹啉1mg／ml，用1mol／Lp H8．0Tris HCl洗一次，再用0．1mol／LTris HClp H8．0洗两次。苯酚p H在7．6～7．8之间。

（15）苯酚∶氯仿混合液（3∶1）：苯酚加上等体积氯仿并用水饱和，混合液分层，上层为水相，下层为有机相且带黄色。苯酚和氯仿都是蛋白质变性剂，苯酚使蛋白质变性的作用强于氯仿，但氯仿具有较好的分层作用。

（16）无水乙醇：DNA在p H7．4条件下分子带负电，在Na Cl存在条件下，DNA盐呈电中性，乙醇将DNA分子周围的水分夺去，DNA失水形成白色絮状沉淀。

（17）TE缓冲液：50mmol／LTris HClp H7．0，5mmol／LEDTA（1mol／LTris HCl p H7．410ml，0．5mol／LEDTA，用蒸馏水稀释至1000ml）。

（18）RNase10mg／ml：称取RNase溶解在10mmol／LTris HClp H7．5和15mmol／L Na Cl溶液中使之浓度为10mg／ml。100℃加温15min，使夹杂的少许DNase失活，然后慢慢冷却，分装于小管中－20℃保存。

（19）蛋白酶K（10mg／ml）：－20℃保存。蛋白酶K的优点是水解能力很强，作用广泛，可与SDS及EDTA合并使用。(www.chuimin.cn)

（20）20％SDS。

（21）0．5mol／LEDTA。

【实验内容和方法】

取新鲜鼠肝，用冰生理盐水洗去血水，用滤纸吸干后，在－70℃冰箱中保存，用时取出。

（1）1g鼠肝加10ml裂解缓冲液，在组织匀浆器中匀浆约1min（30s×2次）。

匀浆液经抽提离心后的分层见图2-13-3。

图2-13-3 匀浆液经抽提离心后的分层

（2）取塑料离心管1支加入1／3支匀浆液（若匀浆液太稠，则再加入1ml TE缓冲液），再加入等体积苯酚∶氯仿混合液轻缓地来回摇动5min，抽提，然后离心（10000rpm，5min），将水相吸入另一干净的离心管中，重复抽提两次。

注意：每次水相时不要将界面上的变性蛋白质混入，抽提两次后一般有机相和水相界面上的变性蛋白质极少，肉眼基本看不见。若界面上变性蛋白质仍较多，可增加抽提次数。

（3）水相加入一刻度离心管后，加入2．5倍体积的冰无水乙醇（可用刻度离心管测量体积）。加5mol／LNa Cl到终浓度为0．1mol／L，在离心管中轻缓地混匀，此时可见白色絮状沉淀，此即DNA粗制品。

（4）用玻棒捞起DNA沉淀，放入小烧杯中，用70％乙醇洗涤沉淀一次，洗涤时动作要轻，防止DNA被切断。

（5）沉淀取出，放入一干净的塑料离心管中，用1ml TE缓冲液溶解。

（6）在1ml DNA溶液中加入10mg／ml RNA酶20μl，使最终浓度达到200μg／ml，在37℃水浴中保温30min。

（7）加入20％SDS25μl，使最终浓度至0．5％；加入0．5mol／LEDTA30μl至终浓度20mmol／L；加10mg／ml蛋白酶K20μl，使最终浓度为200μg／ml，在50℃水浴中保温30min。

（8）加等体积苯酚∶氯仿混合液抽提，重复一次，去除蛋白酶K及其他残留的蛋白质，至界面无明显的变性蛋白质为止。每次抽提时轻缓地来回摇动5min，离心（1000rpm，5min）。吸取水相，至一干净刻度离心管中量出体积，再加入2．5倍体积的冰无水乙醇，加9．5mol／LNa Cl至终浓度为0．1mol／L，混匀后可得较纯的DNA沉淀，再用70％乙醇洗涤沉淀一次。

（9）在一干净的塑料离心管中用0．3～0．5ml缓冲液溶解沉淀，得到提纯的DNA原液。

（10）吸取DNA原液100μl，用TE缓冲液稀释至3ml（1∶30稀释）（若DNA原液太浓，取原液50μl，太稀则取原液200μl）。在紫外分光光度计中测定O．D260nm及O．D280nm的读数。计算：O．D260nm／O．D280nm比值、DNA浓度及DNA总量。将剩余原液写上自己的学号，交给带教老师保存，留作PCR实验使用。

（11）结果检测：紫外分光光度计检测A260／A280，A260为1相当于50μg双链DNA／ml。得到的A260／A280应为1．6～1．9，片段大小为20～100kb。得到的DNA片段大小取决于提取过程中机械外力对DNA的破坏程度。DNAzol有毒害性，应避免直接接触皮肤和眼睛。

【注意事项】

（1）为尽可能避免DNA大分子的断裂，在实验过程中必须做到：①匀浆时应保持低温，匀浆时间应短，勿用玻璃匀浆器。②实验中使用的吸取DNA水溶液的滴管管口需粗而短，并烧成钝口。③用苯酚抽提时勿剧烈振摇。

（2）保持DNA活性，避免酸、碱或其他变性因素使DNA变性。

（3）苯酚是一种强烈的蛋白质变性剂。实验时，应戴手套操作，避免接触皮肤，以免灼伤。苯酚蒸汽的毒性较大，实验中应注意将盛酚试剂的瓶盖好。

（4）离心时要注意管子间的重量平衡。管子要对称放置，当离心达到所需速度后再开始计时。

【想一想】

（1）若样品中有蛋白质存在，其紫外分析结果有何表现？如何进一步纯化？

（2）DNA的定量可采用哪些方法？目前常用的是哪种？如何测定DNA的含量？

（3）从生物细胞中提取DNA的主要注意点是什么？应如何控制？

（4）能引起DNA变性的因素有哪些？DNA降解和DNA变性有何区别？如何鉴别？