DNS氨基酸双向聚酰胺层析实验|正常人体学实验指导

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：通过各物质的吸附力和分配系数不同的原理，使得被分离的物质在聚酰胺薄膜层析中得到分离。因此，可用荧光检测DNS氨基酸的存在。这时，可选择用另一种溶剂系统进行第二向层析，这样可使在第一相中不能分清的DNS 氨基酸得到分离。图2-13-2 DNS氨基酸单向层析图谱在实验操作中应注意不要污染聚酰胺薄膜。

【实验目的】

（1）掌握：聚酰胺薄膜层析技术的原理；制备聚酰胺薄膜层析技术分离6种氨基酸的操作和方法（包括点样、展层和定性）；绘制DNS氨基酸层析图。

（2）熟悉：DNS氨基酸的制备；此薄膜层析方法的流动相和固定相各起的作用。

【实验原理】

聚酰胺薄膜层析是一类较特殊的吸附分配层析。混合物随流动相通过聚酰胺薄膜时，由于被分离的物质与聚酰胺薄膜上的酰胺基团形成氢键，各种物质形成氢键能力的强弱不同，决定了吸附力的差异。吸附力强，展层速度较慢；吸附力弱，展层速度较快。同时，展层溶剂与被分离物质在聚酰胺粒子表面竞争形成氢键，选择适当的展层溶剂，使被分离物质在溶剂与聚酰胺薄膜表面之间的分配系数产生最大差异。一般来讲，易溶于展层剂的所受到的动力作用大，展层速度快；反之速度就慢。通过各物质的吸附力和分配系数不同的原理，使得被分离的物质在聚酰胺薄膜层析中得到分离。

分离物质在聚酰胺薄膜上移动速率用Rf值表示：

Rf＝原点（点样点）到层析点中心的距离／原点到溶剂前沿的距离

二甲氨基萘磺酰氯（1 dimethylaminonaphthalene5sulfonylchloride，简称DNSCl）可与氨基酸的游离氨基结合成DNS氨基酸，反应过程如下：

形成的DNS氨基酸在紫外线照射下发出强烈的黄色荧光。因此，可用荧光检测DNS氨基酸的存在。此反应的灵敏度高，10－9～10－10g氨基酸即可检出，比茚三酮的反应灵敏度高10倍以上。

聚酰胺是一类化学纤维原料。本实验所用的材料是己二酸与己二胺合成的锦纶66，这类高分子物质中含有大量酰胺基团，故称为聚酰胺。这些酰胺基团上的氨基可与氨基酸中的羰基形成氢键，而酰胺基团的羰基又可与氨基酸中的羟基或酚羟基形成氢键。

由于有些氨基酸的结构很相似（如甘氨酸与丙氨酸、谷氨酸与天冬氨酸），如果只采用一种溶剂系统进行单向层析，仍难达到完全分离的目的。这时，可选择用另一种溶剂系统进行第二向层析，这样可使在第一相中不能分清的DNS 氨基酸得到分离。这种层析方法成为双向层析。

【实验器材】

（1）紫外灯、温箱、电吹风、毛细玻璃管和滴管、小试管、层析缸。

（2）聚酰胺薄膜（4cm×4cm）。

（3）环形针、铅笔、直尺。

（4）p H试纸（p H1～14）。

（5）混合氨基酸溶液：称取甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸及亮氨酸各5mg，天冬氨酸20mg，丝氨酸、谷氨酸各40mg，赖氨酸50mg、溶于10ml0．2mol／LNa HCO3溶液中。

（6）0．2mol／LNa HCO3溶液，用去离子水配制，并用Na OH调至p H9．8。

（7）DNSCl丙酮液：用丙酮（AR）溶解DNS Cl，配成2．5mg／ml溶液，密闭置冰箱中保存。

（8）展层剂：①苯∶冰醋酸9∶1（V／V）。②甲酸∶水1．5∶100（V／V）。

（9）其他试剂：1mol／LHCl，1mol／LNa OH，水饱和的乙酸乙酯。(www.chuimin.cn)

【实验内容和方法】

1．DNS氨基酸的制备取一支小试管，加入混合氨基酸5滴，然后加DNS Cl丙酮液4滴摇匀，用软木塞封口，放入40℃温箱中保温30min。取出后，用电吹风的热风吹出丙酮，再用1mol／LHCl酸化至p H2～3（用p H试纸，注意用最小体积），如果酸化过分，p H＜2～3，可用1mol／LNa OH校回。再加水饱和的乙酸乙酯6～7滴摇匀，待分层，上层乙酸乙酯溶液含DNS氨基酸，呈黄绿色荧光。

2．混合DNS氨基酸的双向层析

（1）点样：取一张4cm×4cm聚酰胺薄膜，用铅笔轻轻地在右下角距两边1cm处画点作为原点（图2-1-31左），用毛细玻璃管在原点处点上混合DNS氨基酸样品，点样的直径控制在2～3mm。

（2）层析：以苯冰醋酸溶剂系统为第一相层析，将点好样品的薄膜固定在被扳成“八”字形的环形针内，放入苯冰醋酸展层剂中展层（图2-13-1右）。展层剂前缘达薄膜顶端2mm处即可停止。

图2-13-1 聚酰胺薄膜的点样和层析支架

（3）第一相层析：用电吹风的冷风吹干膜片，在紫外灯下观察一下层析情况。

（4）第二相层析：调转90°与第一相垂直，将环形针固定放入甲酸水展层剂中，进行第二相层析。

（5）观察：用电吹风的冷、热风交替吹干，在紫外灯下观察结果，并用铅笔轻轻描出荧光位置。对照图2-1-3 2中DNS 氨基酸单向层析的Rf值来确定各荧光点分别是哪个氨基酸。

图2-13-2 DNS氨基酸单向层析图谱

【注意事项】

（1）在实验操作中应注意不要污染聚酰胺薄膜。

（2）点样时注意取上层乙酸乙酯层，不要将毛细玻璃管伸到下层水相。严格控制点样位置及点样直径。

（3）层析时勿将原点浸入溶剂系统，层析薄膜在层析缸内须保持直立状态。