正常人体学实验指导：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：血清蛋白在醋酸纤维薄膜上可分成5～7条区带，每条区带是否分别只代表一种蛋白质？电场强度愈高，血清蛋白在醋酸纤维薄膜上的泳动率愈高，是否电场愈高愈好？

【实验目的】

（1）掌握：血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳原理；与薄膜电泳迁移率有关的各种因素；薄膜电泳的局限性；电渗的证明方法。

（2）熟悉：电场强度与蛋白质变性的关系；血清蛋白醋酸纤维薄膜电泳后染色条带脱色、定量的方法。

【实验原理】

血清蛋白的p I都在7．5以下，在p H8．6的巴比妥缓冲液中以负离子的形式存在，分子大小、形状也各有差异，所以在电场作用下，可在醋酸纤维薄膜上分离成A、α1、α2、β、γ五条区带。电泳结束后，将醋酸纤维薄膜置于染色液，使蛋白质固定并染色，再脱色（洗去多余染料）。将经染色后的区带分别剪开，将其溶于碱液中，进行比色测定，计算出各区带蛋白质的百分数。也可将染色后的醋酸纤维薄膜透明处理后在扫描光密度计上绘出电泳曲线，并可根据各区带的面积计算各组分的百分数。

【实验器材】

（1）电泳仪：包括直流电源整流器和电泳槽两个部分。电泳槽用有机玻璃或塑料等制成，它有两个电极，用白金丝制成。

（2）巴比妥缓冲液（p H8．6，离子强度0．06）：巴比妥钠12．76g，巴比妥1．68g，用蒸馏水加热溶解后再加水至1000ml。

（3）氨基黑10B（aminoblack10B）染色液：氨基黑10B0．5g、甲醇50ml、冰醋酸10ml、蒸馏水40ml。

氨基黑10B：分子式C22H13O12N6S3Na3，分子量（MW）为715，λmax为620～630nm。氨基黑是酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐，是最常用的蛋白质染料。但用氨基黑染SDS蛋白时效果不好。另外，氨基黑染不同蛋白质时的差色度不等，色调不一（有蓝、黑、棕等），作用于凝胶柱的扫描时误差较大，需要对各种蛋白质作出本身的蛋白质染料量（吸收值）的标准曲线。

氨基黑钠盐

（4）漂洗液：95％乙醇45ml，冰醋酸5ml，蒸馏水50ml。

（5）丽春红S染色液。

（6）3％冰醋酸。

【实验内容和方法】

1．准备与点样

（1）醋纤薄膜为2cm×8cm的小片，在薄膜无光泽面距一端2．0cm处用铅笔画一线，表示点样位置。

（2）将薄膜无光泽面向下，漂浮于巴比妥缓冲液面上（缓冲液盛于培养皿中），使膜条自然浸湿下沉。

（3）将充分浸透（指膜上没有白色斑痕）的膜条取出，用滤纸吸去多余的缓冲液，把膜条平铺于平坦桌面上。

（4）吸取新鲜血清3～5μl，涂于2．5cm的载玻片截面处，或用载玻片截面在滴有血清的载玻片上蘸一下，使载玻片末端蘸上薄层血清，然后成45°角按在薄膜点样线上，移开玻片。

2．电泳将点样后的膜条置于电泳槽架上，放置时无光泽面（即点样面）向下，点样端置于阴极。槽架上以两层纱布作桥垫，膜条与纱布需贴紧，待平衡5min后通电，电压为10V／cm （指膜条与纱布桥总长度），电流0．4～0．6m A／cm宽，通电1h左右关闭电源。(www.chuimin.cn)

3．染色通电完毕后用镊子将膜取出，直接浸于盛有氨基黑10B（或丽春红S）的染色液中，染5min取出，立即浸入盛有漂洗液的培养皿中，反复漂洗数次，直至背景漂净为止，用滤纸吸干薄膜。

4．定量取试管6支，编号码，分别用吸管吸取0．4mol／L氢氧化钠4ml，剪开薄膜上各条蛋白质色带，另于空白部位剪一平均大小的薄膜条，将各条分别浸于上述试管内，不时摇动，使蓝色洗出。约0．5h后，用分光光度计进行比色，波长650nm，以空白薄膜条洗出液为空白对照，读取白蛋白（A），α1、α2、β、γ球蛋白各管的光密度。

5．计算光密度总和T＝A＋α1＋α2＋β＋γ，各部分蛋白质的百分数为（附PI和MW）：

白蛋白％＝A／T×100％ PI4．88 MW69000

α1球蛋白％＝α1／T×100％ PI5．06 MW200000

α2球蛋白％＝α2／T×100％ PI5．06 MW300000

β球蛋白％＝β／T×100％ PI5．12 MW9000～150000

γ球蛋白％＝γ／T×100％ PI6．85～7．5 MW156000～300000

另外，也可将经电泳染色后的干燥薄膜浸于冰醋酸∶95％乙醇（2∶8）溶液中20min，取出后将薄膜平贴于玻板上，干燥过程中薄膜渐变透明。此透明薄膜可用扫描光密度计描绘出电泳曲线，并可根据曲线的面积计算各组分的百分数。

●正常参考值：白蛋白 57％～72％

α1球蛋白 2％～5％

α2球蛋白 4％～9％

β球蛋白 6．5％～12％

γ球蛋白 12％～20％