蛋白质、葡萄糖定量测定方法及实验指导

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：标准曲线法测定蛋白质含量掌握分光光度计的使用方法。掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。蛋白质含有两个以上肽键，因此有双缩脲反应。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用比色法测定，制作标准曲线并测定蛋白质含量。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

标准曲线法测定蛋白质含量

【实验目的】

（1）掌握分光光度计的使用方法。

（2）掌握标准曲线法测物质含量的方法。

（3）掌握双缩脲法测定蛋白质含量的方法。

【实验原理】

蛋白质定量结果是生物医学研究中的基础数据，其准确与否关系到研究结果的可靠程度。一般用分光光度法测物质的含量，先要制作标准曲线，然后根据标准曲线查出所测物质的含量。因此，制作标准曲线是生物检测分析的一项基本技术。

蛋白质含有两个以上肽键，因此有双缩脲反应。在碱性溶液中，蛋白质与Cu2＋形成紫红色络合物，此紫红色络合物颜色的深浅与蛋白质的含量成正比。

双缩脲是由两分子尿素缩合而成的化合物，在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色络合物，此反应即为双缩脲反应。含有两个或两个以上肽键的化合物都具有双缩脲反应。蛋白质含有多个肽键，在碱性溶液中能与Cu2＋络合成紫红色化合物。其颜色深浅与蛋白质的浓度成正比，而与蛋白质的相对分子量及氨基酸成分无关，故可用比色法测定，制作标准曲线并测定蛋白质含量。测定范围为1～10μg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。

双缩脲的合成过程如下：

紫红色铜双缩脲复合物分子结构为：

【实验器材】

（1）双缩脲试剂：溶解1．5g硫酸铜（Cu SO4·5H2O）和6．0g酒石酸钾钠（Na KC4H4O6· 4H2O）于500ml蒸馏水中，在搅拌下加入300ml2．5mol／L氢氧化钠溶液、KI1．0g，用水稀释到1000ml。在棕色瓶中避光保存。长期放置若出现暗红色沉淀，即弃之。

（2）蛋白质标准液：取牛血清白蛋白，用生理盐水稀释至浓度10g／L。

（3）试管、移液管、坐标纸等。

（4）恒温水浴箱。

（5）分光光度计。

【实验内容和方法】

1．准备按表2-13-1平行加入各项试剂。

表2-13-1 测定蛋白质含量时平行添加的试剂剂量

2．测定充分混匀，37℃水浴保温20min，冷却至室温，在分光光度计波长540nm处，用0管校正吸光度为零，读取各管吸光度值。1～5管为标准曲线管，测得吸光度后，以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标绘制标准曲线。测得测定管的吸光度，对照标准曲线求得蛋白质浓度。

【注意事项】

（1）本实验方法测定范围1～10μg的蛋白质。

（2）须于显色后30min内比色测定。30min后，可有雾状沉淀发生。各管由显色到比色的时间应尽可能一致。

（3）有大量脂肪性物质同时存在时，会产生浑浊的反应混合物，这时可用乙醇或石油醚使溶液澄清后离心，取上清液再测定。

（4）双缩脲试剂中加入酒石酸钾钠，Cu2＋形成稳定的络合铜离子，以防止Cu SO4·5H2O不稳定形成Cu（OH）2沉淀。酒石酸钾钠与Cu SO4·5H2O之比不低于3∶1。加入KI作为抗氧化试剂。

（5）双缩脲试剂要封闭储存，防止吸收空气中的二氧化碳。

（6）本法各种蛋白质的显色程度基本相同，重复性好，几乎不受温度影响，唯一的缺点是灵敏度较低。

（7）黄疸血清、严重溶血对本法有干扰。

【想一想】

（1）干扰本实验的因素有哪些？

（2）双缩脲法测定蛋白质含量的原理是什么？还有其他方法测定蛋白质含量吗？

（3）请用双缩脲法，设计一个测定蛋白质含量的定量方法（除标准曲线法外）。

附：其他蛋白质定量技术(www.chuimin.cn)

（1）微量凯氏（Kjeldahl）定氮法。

（2）Folin—酚试剂法（Lowry法）。

（3）紫外吸收法。

（4）考马斯亮蓝法（Bradford法）。

（5）BCA比色法。

标准管法测定葡萄糖含量

【实验目的】

（1）掌握标准管法测物质含量的方法。

（2）掌握酶法测定葡萄糖含量的方法。

【实验原理】

在葡萄糖氧化酶的催化作用下βD葡萄糖氧化成过氧化氢和葡萄糖酸，在过氧化酶的存在下，过氧化氢与苯酚、4氨基安替比林与偶联酚缩合成可被分光光度计测定的红色醌类化合物，即所谓的Trinder反应。其红色在510nm波长处有最大吸收峰，颜色的深浅在一定范围内与血葡萄糖浓度成正比。

【实验器材】

（1）葡萄糖酶法测定试剂盒。

（2）葡萄糖标准液（5．5mmol／L）。

（3）移液管、微量移液器、37℃水浴。

（4）分光光度计。

【实验内容和方法】

1．准备按表2-13-2添加多项试剂。

表2-13-2 测定葡萄糖含量时添加的试剂剂量

2．测定混匀后在37℃水浴保温20min，在分光光度计510nm波长处，以空白管校正吸光度值为零，在30min内读取测定值。

3．计算葡萄糖含量（mmol／L）＝Au／As×5．5。

●正常参考值：人体正常血糖 3．9～5．8mmol／L（70～105mg／100m L）

● 临床意义

（1）血糖浓度的测定常用于内分泌腺功能的检查，当体内某种激素分泌失常时，都能造成低血糖或高血糖症。

（2）病理性血糖增高：最常见的是糖尿病，当胰岛素分泌功能障碍时，糖代谢发生紊乱，可产生永久性持续的高血糖现象，出现尿糖，称为糖尿病。血糖升高还可见于甲状腺功能亢进、肾上腺功能亢进等病。

（3）血糖过低：可见于胰岛素增多症、过量的胰岛素治疗、胰腺癌、肾上腺皮质功能减退等。

【注意事项】

（1）样品内葡萄糖浓度高于22．2mmol／L时，建议稀释后再测定。

（2）试剂盒可在4℃避光保存1年。

【想一想】

（1）测定血糖有何意义？为何不能使用溶血标本？

（2）颜色的深浅在一定范围内与血葡萄糖浓度成正比，这里的一定范围指什么？

蛋白质、葡萄糖定量测定方法及实验指导

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