常用分子生物学技术介绍

2023-11-09 理论教育版权反馈

【摘要】：据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛、大小不同的DNA片段。每100ml凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，常用T％表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C％表示。

一、核酸分离技术

（一）DNA分离

以提取完整高产量的DNA为目标，步骤主要分为：破碎细胞→抽提蛋白质→DNA沉淀→乙醇洗除盐→琼脂糖凝胶电泳检测。用细胞裂解液裂解细胞膜，收集细胞核，加入SDS破裂核膜，用蛋白酶K使核蛋白降解成小片段并从DNA上解离下来，经苯酚、氯仿抽提去除蛋白质，无水乙醇沉淀DNA，75％乙醇洗涤沉淀DNA，干燥后溶解于TE缓冲液中即得到分子量相对高的DNA。

（二）RNA分离

以提取完整未降解的高纯度的RNA为目标，步骤主要分为：抑制RNase→抽提去蛋白质→DNase消化DNA。RNA比DNA易降解，在抽提过程中需注意抑制RNase的污染及控制操作温度。

（三）琼脂糖凝胶电泳检测DNA

琼脂糖电泳可用于分离、鉴定和提纯DNA片段。本法操作简单、迅速，能分辨其他方法不能分开的DNA片段混合物，分开的DNA可用低浓度的荧光染料（0．5μg／ml溴化乙啶）染色，在紫外线灯下直接观察检测到少至1ng的DNA。

琼脂糖凝胶电泳具有下列优点：

（1）琼脂含液体量大，可达98％～99％，近似自由电泳，但是样品的扩散度比自由电泳小，对蛋白质的吸附极微。

（2）琼脂作为支持体有均匀、区带整齐、分辨率高、重复性好等优点。

（3）电泳速度快。

（4）透明而不吸收紫外线，可以直接用紫外线检测仪作定量测定。

（5）区带易染色，样品易回收，有利于制备。

DNA通过琼脂糖凝胶的迁移率取决于以下参数：

（1）DNA分子大小：线状双链DNA分子通过凝胶的速率与其分子量的常用对数成反比。据此用已知分子量的标准物质和待测分子量的DNA片段同时电泳，比较其电泳速率，即可求出待测片段的分子大小。

（2）琼脂糖浓度：给一定大小的DNA片段，以不同速度通过不同浓度的琼脂扩凝胶。因此利用不同浓度的凝胶，可分辨范围广泛、大小不同的DNA片段。

（3）DNA构型：相同分子量的闭环（Ⅰ型）、开环（Ⅱ型）和线状（Ⅲ型）DNA，以不同速率通过凝胶，一般情况下，迁移率的大小比较：Ⅰ型＞Ⅲ型＞Ⅱ型。

（4）应用的电压：在低电压时，线状DNA片段的迁移率与所用电压成正比。但是电压增高时，大分子量DNA片段迁移率的增大是不同的，因此琼脂糖凝胶的有效分离范围随电压的增大而减小。为了获得DNA片段的最大分辨力，凝胶电泳时电压不应超过5V／cm。

不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围见表1-3-1。

表1-3-1 不同浓度琼脂糖凝胶的分离范围

二、蛋白质分离技术

电泳分离：聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的电泳方法。在这种支持介质上可根据被分离物质分子大小和分子电荷多少来分离。聚丙烯酰胺凝胶有以下优点：（1）聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺和N，N′甲叉双丙烯酰胺聚合而成的大分子。凝胶有格子，是带有酰胺侧链的碳－碳聚合物，没有或很少带有离子的侧基，因而电渗作用比较小，不易和样品相互作用。

（2）由于聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的物质，在聚合前可调节单体的浓度比，形成不同程度交链的结构，其空隙度可在一个较广的范围内变化，可以根据要分离物质分子的大小，选择合适的凝胶成分，使之既有适宜的空隙度，又有比较好的机械性质。一般来说，含丙烯酰胺7％～7．5％的凝胶，其机械性能适用于分离分子量范围为1万～100万物质；1万以下的蛋白质则采用含丙烯酰胺15％～30％的凝胶；而分子量特别大的可采用含丙烯酰胺4％的凝胶。大孔胶易碎，小孔胶则难从管中取出，因此当丙烯酰胺的浓度增加时可以减少双含丙烯酰胺，以改进凝胶的机械性能。

（3）一定浓度范围内的聚丙烯酰胺对热稳定。凝胶无色透明，易观察，可用检测仪直接测定。

（4）丙烯酰胺是比较纯的化合物，可以精制，减少污染。合成聚丙烯酰胺凝胶的原料是丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺。丙烯酰胺称为单体，甲叉双丙烯酰胺称为交联剂，在水溶液中，单体和交联剂通过自由基引发的聚合反应形成凝胶。

在聚丙烯酰胺凝胶形成的反应过程中，需要有催化剂参加，催化剂包括引发剂和加速剂两部分。引发剂在凝胶形成中提供始自由基，通过自由基的传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应；加速剂则可加快引发剂释放自由基的速度。常用的引发剂和加速剂的配伍如表1-3-2：(www.chuimin.cn)

表1-3-2 常用引发剂和加速剂的配伍

用过硫酸铵引发的反应称化学聚合反应；用核黄素引发，需要强光照射反应液，称光聚合反应。

聚丙烯酰胺聚合反应受下列因素影响：

（1）大气中氧能淬灭自由基，使聚合反应终止，所以在聚合过程中要使反应液与空气隔绝。

（2）某些材料如有机玻璃能抑制聚合反应。

（3）某些化学药物可以减慢反应速度，如铁氰化钾（赤血盐）。

（4）温度高聚合快，温度低聚合慢。

以上几点在制备凝胶时必须注意。凝胶的筛孔、机械强度及透明度等很大程度上由凝胶的浓度和交联决定。每100ml凝胶溶液中含有单体和交联剂的总克数称凝胶浓度，常用T％表达；凝胶溶液中交联剂占单体和交联体总量的百分数称为交联度，常用C％表示。

交联度过高，胶不透明并缺乏弹性；交联度过低，凝胶呈糊状。聚丙烯酰胺凝胶具有较高的黏度，它不防止对流减低扩散的能力，而且因为它具有三度空间网状结构，某分子通过这种网孔的能力将取决于凝胶孔隙和分离物质颗粒的大小和形状，这是凝胶的分子筛作用。由于这种分子筛作用，这里的凝胶并不仅是单纯的支持物，因此，在电泳过程中除了注意电泳的基本原理以外，还必须注意与凝胶本身有关的各种性质（网孔的大小和形状等）。

有人测定了总浓度为20％的丙烯酰胺液，在六种不同比例的双丙烯酰胺的存在下，聚合后的网孔大小。发现孔径与总浓度有关，总浓度愈大，孔径相应变小，机械强度增强。在总浓度不变时，甲叉双丙烯酰胺的浓度在5％时孔径最小，高于或低于此值时，聚合体孔径都相对变大。凝胶孔径在凝胶电泳中是一个重要的参数，它往往决定了电泳的分离效果。经过不断的实践，得到了如表1-3-3所示的经验值，在一般情况下，大多数生物体内的蛋白质采用7．5％浓度的凝胶，所得电泳结果往往是满意的，因此称由此浓度组成的凝胶为“标准凝胶”。对那些用于重要研究的凝胶，最好通过采用10％的一系列凝胶浓度梯进行预先试验，以选出最适的凝胶浓度。

表1-3-3 不同分子量物质的适用凝胶浓度

聚丙烯酰胺凝胶电泳可分为连续的和不连续的两类。前者指整个电泳系统中所用的缓冲液、p H和凝胶网孔都是相同的；后者指在电泳系统中采用了两种或两种以上的缓冲液、p H和孔径，不连续电泳能使稀的样品在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨能力。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入一种试剂使电荷因素及分子的形状消除，那么电泳迁移率就取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。1967年，Shapiro等发现阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS）具有这种作用。通过向样品中添加巯基乙醇和过量SDS，使蛋白质变性解聚，并让SDS与蛋白质结合成带强负电荷的复合物，从而掩盖蛋白质之间原有电荷的差异。SDS通常与蛋白质以1．4∶1的重量比结合，所引入净电荷量约为蛋白质本身静电荷的10倍，从而形成具有均一电荷密度和相同荷质比的SDS蛋白质复合物。该复合物所带的电荷远远超过蛋白质原有的净电荷，从而消除或大大降低了不同蛋白质之间所带净电荷的不同对电泳迁移率的影响。SDS蛋白质复合物具有扁平而紧密的椭圆形或棒状结构，棒的短轴在18的数量级，保持恒定，而长轴的变化正比于蛋白质的分子量。因此，SDS蛋白质复合物消除了蛋白质天然形状的不同对电泳迁移率的影响。因此，蛋白质在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS PAGE）中的迁移率主要取决于其分子大小。由于SDS与蛋白质的结合，电泳迁移率在外界条件固定的情况下，只取决于蛋白质分子量大小这一因素，使得SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳具有分辨率高、重复性好等特性，因此被广泛应用于未知蛋白质分子量的测定。

三、分子克隆技术

（一）限制性内切酶酶切与连接

基因克隆也叫DNA分子克隆，即在体外重组DNA分子，实现该技术的关键是一种被称作限制性核酸内切酶的工具酶。每一种限制性核酸内切酶可以识别DNA分子上特定的碱基序列，切断DNA分子。依据碱基互补的原理，在DNA连接酶的作用下可以把切开的DNA片段连接起来，因此可以把目的片段连接到合适的载体上形成重组子。

（二）转化与转染

作为表达载体，必须具有复制起始序列、多克隆位点及选择标记的功能，可以在宿主细胞中进行自我复制或整合到宿主基因组中进行复制。作为宿主的工程菌或细胞在某些化学条件或物理刺激下会改变其细胞膜的通透性，从而易于将细胞表面附着的外源基因吸收到细胞内，这一过程即转化（工程菌）或转染（细胞）。

利用选择标记可以很容易地鉴别成功导入目的基因的工程菌或细胞，如抗生素抗性筛选。凡是成功导入重组载体的工程菌或细胞均获得某种抗生素抗性，而未导入的工程菌或细胞则不能在含该抗生素的培养基中生长。

（三）聚合酶链式反应

聚合酶链式反应，即PCR。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。PCR各步骤如下：

（1）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构，使DNA充分变性，减少DNA复杂结构对扩增的影响，以利于引物更好地和模板结合，特别是对于基因组来源的DNA模板，最好不要吝啬这个步骤。此外，在一些使用热启动Taq酶的反应中，还可激活Taq酶，从而使PCR反应得以顺利进行。

（2）变性—退火—延伸循环：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备。②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。③引物的延伸：DNA模板引物结合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以d NTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复循环变性—退火—延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4min，2～3h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

（3）PCR仪扩增循环后72°延伸10min：用PCR仪扩增时，变性—退火—延伸循环完成后，继续72°延伸10min的原因：①延伸时间取决于待扩增DNA片段的长度（当然是在反应体系一定的条件下）。②根据延伸速率推得，扩增1kb以内的DNA片段1min即可，而3～4kb则需要3～4min，依次照推。通常在最后一轮要适当地将延伸时间延长至4～10min，这样做是使PCR反应完全，以提高扩增产量。③继续72°延伸10min除了可以使PCR反应完全以提高扩增产量外，还有一个作用是：在用普通Taq酶进行PCR扩增时在产物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的进行。

整个分子克隆从设计引物开始，根据需要拿到的目的蛋白质相应的核酸序列，设计出含有酶切位点及所需Tag的特异性引物，图1-3-1给出了分子克隆的基本流程：

图1-3-1 分子克隆的基本流程

常用分子生物学技术介绍

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