溶菌酶结晶提取与酶活力测定的实验结果

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：溶菌酶广泛用于医学临床，有抗菌的作用，可抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等。另外，近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。测定溶菌酶活力时，可用某些细菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活力的大小。因此，可利用测定450nm波长下，菌悬液在该酶作用后透光度增加，以此表示溶菌酶的活力。计算所得溶菌酶的酶活力单位。

【目的要求】

1.掌握从蛋清中制备溶菌酶的原理和方法。

2.学习用菌悬液测定溶菌酶活力的方法。

【实验原理】

溶菌酶（EC3.2.1.17）又称细胞壁质酶或N-乙酰基胞壁酰水解酶，是糖苷水解酶，作用于N-乙酰氨基葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1，4糖苷键。相对分子质量14307，由129个氨基酸残基组成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达11左右。

溶菌酶广泛用于医学临床，有抗菌的作用，可抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等。还是优良的天然防腐剂，可用于食品的防腐保鲜。另外，近年来溶菌酶已成为基因工程及细胞工程必不可少的工具酶。

溶菌酶在鸡蛋清中含量较丰富，从1个鸡蛋中可获得20mg左右的冻干粉。蛋清溶菌酶很容易形成单晶，被作为蛋白结晶中的模型蛋白。最早的蛋清溶菌酶单晶是在1946年由Alderton获得的，此后溶菌酶的结晶被广泛应用于蛋白质结晶机理和方法的研究。晶体生长的过程是一个由非晶相到晶相的转变过程，溶液中的相变驱动力是过饱和度。从溶液中得到结晶，首先要使溶液达到过饱和，之后再由过饱和度驱动相变，使溶质从液相转变为晶相，得到晶体。

从鸡蛋清中分离溶菌酶可以选用多种不同的方法和步骤，本实验选用等电点沉淀和盐析法。蛋白质在等电点时溶解度最低，所以蛋白质的沉淀在等电点附近最为显著。若向蛋清中加入一定量的中性盐，并调节pH至溶菌酶的等电点，在适当的温度下，静止若干时间，溶菌酶就会以结晶形式从溶液析出。

溶菌酶可以溶解以肽聚糖为主要成分的细菌细胞壁。测定溶菌酶活力时，可用某些细菌细胞壁作底物，以单位时间内被它水解的细胞壁的量表示酶活力的大小。例如，溶菌酶对溶壁微球菌（Micrococcus lysodeikticus）作用后，细胞壁溶解，细菌解体，菌悬液透明度增加，透明度增加的程度与溶菌酶活力成正比。因此，可利用测定450nm波长下，菌悬液在该酶作用后透光度增加，以此表示溶菌酶的活力。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）鸡蛋清（pH不低于8.0）。

（2）氯化钠（CP）。

（3）丙酮（CP）。

（4）1mol/L NaOH溶液。

（5）0.1mol/L pH6.2磷酸缓冲液称取NaH₂PO₄·2H₂O11.70g，NaHPO₄·12H₂O7.86g及EDTA0.392g，溶于蒸馏水并稀释出1000mL，用pH计校正。

（6）溶菌酶晶种 5%溶菌酶溶液10mL，加NaCl0.5g，滴加1mol/L NaOH溶液调至pH9.5～10.0，溶液置4℃冰箱中，1～2d内溶菌酶晶体即析出。吸滤取得晶体，用冷丙酮洗晶体2次，放置真空干燥器中干燥。

（7）液体培养基牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，蛋白胨1g，溶于蒸馏水并稀释至100mL。分装于锥形瓶中，高压灭菌15min，备用。

（8）固体培养基琼脂20g，牛肉膏5g，氯化钠5g，蛋白胨10g，溶于1000mL蒸馏水（加热），分别装于250mL三角瓶中，高压灭菌15min，冷却凝固，备用。

（9）溶壁微球菌中国科学院微生物研究所提供。

2.器材

吸管（0.2mL、5.0mL）；烧杯（100mL）；匀浆器；量筒（100mL、50mL）；电子天平；抽滤瓶（500mL）；真空干燥器；纱布；显微镜；分离器；培养箱；恒温水浴锅；可见分光光度计；三角瓶。

【操作方法】

1.结晶溶菌酶的制备

（1）蛋黄与蛋清分离将1只新鲜鸡蛋去壳，用分离器将蛋黄与蛋清分离。

（2）蛋清预处理将蛋清置于小烧杯中（蛋清pH不得低于8.0），慢慢搅拌数分钟，使蛋清稠度均匀，然后用两层纱布滤去卵带或碎蛋壳。(www.chuimin.cn)

（3）按100mL蛋清加5g氯化钠的比例，向蛋清内慢慢加入氯化钠细粉，边加边搅，促使氯化钠细粉及时溶解，以避免局部浓度过高或沉淀于容器底部，用1mol/L NaOH调节pH至9.5～10.0，随加随搅匀，避免局部过碱。

（4）加入少量溶菌酶结晶作为晶种，4℃放置数天（72～96h达到最高产率）。当观察有结晶形成后，吸取晶液一滴置载玻片上，用100倍显微镜观察。

（5）4000r/min 10min离心收集，0℃丙酮洗涤2次，转移到干燥的研钵中，自然干燥得酶粉。

2.酶活力测定

（1）底物的制备将溶壁微球菌接种于斜面培养基上，28℃培养24h，再接种固体平板，28℃48h，用蒸馏水将菌体洗下离心4000r/min，10min，倾去上清液，沉淀为菌体。加入少量蒸馏水，用玻璃棒搅成悬液，离心，倾去上清液，如此反复洗涤菌体数次（洗涤1次为4000r/min10min）得到菌体。

（2）底物的配制加一定量的pH6.2磷酸缓冲液于菌体离心管中，振荡，制成菌悬液，比色测定450nm波长下吸光度，此悬液吸光度应控制在0.5～0.7范围内。

（3）酶液的制备准确称取干酶粉10mg，用0.1mol/L pH6.2磷酸缓冲液5mL溶解成2mg/mL酶液。用时稀释20倍，则每毫升酶液酶量为100μg。

（4）将酶液和底物悬液分别置25℃水浴中保温10～15min，然后吸底物悬液3.0mL置比色杯中，于450nm波长下读出吸光度，此时为零时读数。然后加入酶液0.1mL（10μg酶），迅速混合，同时用秒表计算时间，每隔30s读一次吸光度，共测5次（120s）。

酶活力单位定义：25℃，pH6.2，波长为450nm时，平均每分钟引起菌悬液吸光率下降0.001的酶量为一个酶活力单位。

式中 A₀——零时450nm处的吸光度；

A₁——1min时450nm处的吸光度；

m——样品的质量，mg；

1000——0.001的倒数，即相当于除以0.001。

3.结果处理

（1）绘制观察到的溶菌酶结晶形态。

（2）计算所得溶菌酶的酶活力单位。

【要点提示】

1.必须避免氯化钠沉于容器底部，否则将因局部盐浓度过高而产生大量白色沉淀。

2.最初一段时间（30s）因稀释，会有假象，数据不很可靠，因此计算时应取直线部分。

【思考题】

1.溶菌酶有何用途？除了鸡蛋清外，人体中什么部分也分泌溶菌酶？

2.你认为还可以选用哪些方法和步骤从鸡蛋清中分离溶菌酶？

3.分光光度法测定溶菌酶活力的原理是什么？注意事项有哪些？

4.溶菌酶的特性有哪些？

5.蛋白质结晶和沉淀的区别是什么？

溶菌酶结晶提取与酶活力测定的实验结果

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