血清γ-球蛋白分离、纯化与鉴定

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：（一）血清γ-球蛋白的分离与纯化1.了解蛋白质分离纯化的总体思路。本实验在血清中加50%饱和度的硫酸铵，使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解于溶解中，经离心分离获得沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。脱盐后的γ-球蛋白再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。血清γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。合并含有蛋白质的各管，即为已脱盐的γ-球蛋白溶液，待进一步纯化。

（一）血清γ-球蛋白的分离与纯化

【目的要求】

1.了解蛋白质分离纯化的总体思路。

2.掌握盐析法、分子筛层析、离子交换层析等实验原理及操作技术。

【实验原理】

血清中含有清蛋白和各种球蛋白（α-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白等），由于它们所带电荷不同、相对分子质量不同，在高浓度盐溶液中的溶解度不同，因此可利用它们在中性盐溶液中溶解度的差异而进行沉淀分离，此法称为盐析法。本实验在血清中加50%饱和度的硫酸铵，使球蛋白沉淀析出，清蛋白则仍溶解于溶解中，经离心分离获得沉淀部分即为含有γ-球蛋白的粗制品。

用盐析法分离而得的蛋白质含有大量的硫酸铵，会妨碍蛋白质的进一步纯化，因此必须去除，常用的有透析法、凝胶过滤法等。本实验采用凝胶过滤法，利用蛋白质与无机盐类之间相对分子质量的差异，除去粗制品中盐类。当γ-球蛋白的粗提液流过Sephadex G-25凝胶柱时，溶液中分子直径大的蛋白质沿凝胶颗粒间的空隙以较快的速度流过凝胶柱，最先流出柱外，而分子直径小的无机盐因进入凝胶内部的微孔中向下移动的速度较慢，所以最后流出柱外。这样经过凝胶层析后可以达到脱盐的目的。

脱盐后的γ-球蛋白再经DEAE纤维素层析柱进一步纯化。DEAE纤维素为阴离子交换剂，带正电荷，在pH6.3的条件下，α-球蛋白和β-球蛋白（pI分别为5.06、5.12）带负电荷，DEAE纤维素能吸附带负电荷的；而γ-球蛋白（pI7.3）在此条件下带正电荷，不被吸附故直接从层析柱流出，此时收集的流出液即为纯化的γ-球蛋白。

经DEAE纤维素阴离子交换柱纯化的γ-球蛋白液往往体积较大，样品质量分数较低。为便于鉴定，常需浓缩。浓缩的方法很多，本实验选用聚乙二醇透析浓缩的方法。

血清γ-球蛋白分离纯化后，选用醋酸纤维薄膜电泳法鉴定其纯度。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）饱和硫酸铵溶液称取固体硫酸铵850g加入1000mL蒸馏水中，在70～80℃下搅拌促溶，室温中放置过夜，瓶底析出白色结晶，上清液即为饱和硫酸铵溶液。

（2）0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）3.121g溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000mL为A液。称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）7.164g，溶于蒸馏水中，加蒸馏水稀释至1000mL为B液。取A液68.5mL，B液31.5mL，混匀后即成。

（3）300g/L三氯乙酸。

（4）奈氏试剂。

（5）葡聚糖凝胶G-25。

（6）DEAE纤维素。

（7）新鲜血清。

（8）聚乙二醇6000。

2.器材

离心机；刻度离心管；pH试纸；抽滤瓶；贮液瓶；层析柱（1.5cm×20cm）；透析袋；移液枪；布氏漏斗；黑、白反应板；铁架台；培养皿。

【操作方法】

1.硫酸铵盐析

（1）取刻度离心管1支，加入新鲜血清1mL和生理盐水1mL混匀，然后边摇边缓慢滴入饱和硫酸铵溶液2mL，混匀后室温下放置10min，此蛋白质溶液的硫酸铵浓度为50%饱和度。

（2）将离心管平衡后置于离心机中，3000r/min离心10min。弃去含清蛋白的上清液，向沉淀中加入0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液1mL使之溶解，此液即为γ-球蛋白粗提液。

2.凝胶柱层析脱盐

（1）凝胶的处理量取30mL Sephadex G-25，加入2倍量的0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，置于沸水浴中1h，并经常摇动使气泡逸出。取出冷却，待凝胶下沉后，倾去含有细微悬浮物的上层液。

（2）装柱平衡选用1.5cm×20cm层析柱，垂直夹于铁架台上。向柱内加入少量0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液，将上述处理过的凝胶粒悬液连续注入层析柱内，直至所需凝胶床高度距层析柱上口3～4cm为止。装柱时应注意凝胶粒装填均匀，凝胶床内不得有界面和气泡，凝胶床面应平整。打开下口夹，调节柱下端螺旋夹流速为2mL/min，用2倍柱床体积的磷酸盐缓冲液平衡。关闭下口夹。

（3）上样与洗脱打开下口夹，使床面上的缓冲液流出，待液面降到凝胶床表面时，关闭出水口。用滴管吸取盐析所得γ-球蛋白溶液，在距离床面1mm处沿管内壁轻轻转动加进样品，切勿搅动床面。然后打开下口夹，使样品进入床内，直到与床面平齐为止。立即用1mL0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液冲洗柱内壁，待缓冲液进入凝胶床后再加少量缓冲液。如此重复2次，以洗净内壁上的样品溶液。然后再加入适量缓冲液于凝胶床上，调流速为10滴/min，开始洗脱。用小试管收集流出的液体，每管收集20滴，收集10管后关闭出水口。

（4）检测与蛋白质取黑、白反应板各一块，按洗脱液的顺序每管取一滴，分别滴入反应板中，在黑色反应板中加300g/L三氯乙酸溶液2滴，出现白色混浊或沉淀即表示有蛋白质析出，并记录各管白色混浊程度，以（-）、（+）、（++）、（+++）表示。于白反应板中加入奈氏试剂溶液1滴，观察出现的情况。并用上述符号记录各管颜色变化。合并含有蛋白质的各管，即为已脱盐的γ-球蛋白溶液，待进一步纯化。

3.离子交换层析柱纯化

（1）DEAE纤维素处理量取DEAE-纤维素25mL，加0.5mol/L HCl溶液50mL，搅拌后放置20min，虹吸去除上清液（也可用布氏漏斗抽干），再用蒸馏水反复洗数次直至pH6.0为止。加等体积的0.5mol/L NaOH溶液，搅拌后放置20min，虹吸去除上清液，同上用蒸馏水反复洗至pH＜7.0为止。然后转移到烧杯内，加0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液60mL放置30min。待装柱。

（2）装柱与洗脱取层析柱1.5cm×20cm1支，按以上装柱方法将处理好的DEAE-纤维素装入柱中，然后用0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液平衡。调流速20滴/min，将脱盐后的γ-球蛋白溶液上柱，方法与上述脱盐法相同。同样用300g/L三氯乙酸溶液检查有无蛋白质流出。收集不被纤维素吸附的蛋白质即为纯化的γ-球蛋白溶液。

4.γ-球蛋白溶液浓缩(www.chuimin.cn)

将待浓缩的蛋白质溶液放入较细的透析袋中，置入培养皿内。透析袋周围撒上聚乙二醇。经过一定时间后即可观察到明显的浓缩现象。该浓缩样品留作纯度鉴定。以上物质在使用后可以通过加温及吹风而回收。

【要点提示】

（1）装柱时，不能有气泡和分层现象，凝胶悬液尽量一次加完。

（2）加样时，切莫将床面冲起，不能搅动床面，否则分离带不整齐。

（3）流速不可太快，否则分子小的物质来不及扩散，随分子大的物质一起被洗脱下来，达不到分离目的。

（4）在整个洗脱过程中，始终应保持层析柱床面上有一段蒸馏水，不得使凝胶干结。

【思考题】

1.完全饱和的硫酸铵中清蛋白、球蛋白是否会发生沉淀？

2.为什么葡萄糖凝胶G-25可将γ-球蛋白与硫酸铵分开？

3.试写出分离纯化血清蛋白的操作流程，并说明各分离纯化步骤的理论依据。

（二）血清γ-球蛋白的鉴定——醋酸纤维素薄膜电泳

【实验目的】

1.掌握电泳的基本原理。

2.熟悉醋酸纤维素薄膜电泳的方法和应用。

【实验原理】

蛋白质是两性电解质，在同一pH环境下，混合蛋白质中各种成分带电量不同、分子大小不同，在同一电场中泳动的速度不同，导致相同的时间迁移的距离不同而把它们分开。血清中含有多种蛋白质，用醋酸纤维素薄膜电泳可分为五个区带，γ-球蛋白的等电点为7.3，在pH8.6的巴比妥缓冲液中，带的负电荷最少，因此在电场中比其他蛋白质移动速度慢。而清蛋白等其他蛋白质的等电点均小于7.3，因此在电场中比γ-球蛋白移动速度快。

本实验分离全血清中各种蛋白质成分，同时鉴定上次实验γ-球蛋白的提纯结果。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）巴比妥-巴比妥钠缓冲液（pH8.6，离子强度0.06）称取巴比妥钠12.76g，巴比妥1.66g，蒸馏水溶解并定容至1000mL。

（2）染色液氨基黑10B0.25g，用甲醇50mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解。

（3）漂洗液甲醇或乙醇45mL，冰醋酸5mL，水50mL，混匀。

2.器材

电泳仪；电泳槽；醋酸纤维薄膜；大培养皿；吸量管；竹镊子；吹风机。

【操作方法】

1.取醋酸纤维薄膜2张，在薄膜的无光泽面的1.5cm处用铅笔轻轻画一条线。

2.将薄膜浸入pH8.6的巴比妥-巴比妥钠缓冲液中，浸泡约30min。

3.将完全浸透的薄膜轻轻取出，平铺在滤纸上，用滤纸吸去多余的缓冲液。分别用点样器蘸取正常血清和γ-球蛋白溶液点在点样线上。