PCR技术：简介与原理

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：聚合酶链式反应是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。延伸 70～74℃时，在TaqDNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg2+存在的条件下，以引物3′端为起始点沿着互补的单链模板进行DNA链延伸反应。

【目的要求】

1.学习聚合酶链式反应的原理。

2.掌握PCR扩增DNA的操作方法。

【实验原理】

聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）是20世纪80年代后期由K.Mullis等建立的一种体外酶促扩增特异DNA片段的技术。PCR是利用针对目的基因所设计的一对特异寡核苷酸引物，以目的基因为模板进行的DNA体外合成反应。由于反应循环可进行一定次数，所以在短时间内即可扩增获得大量的目的基因。PCR技术具有高灵敏度、特异性强、操作简便等特点。虽然PCR技术也存在出错倾向高、产物大小受到限制和必须先有目标DNA序列等缺点，但仍被誉为20世纪分子生物学研究领域最伟大的发明之一，Mullis也因贡献卓著而获得1993年度诺贝尔奖。PCR是由（变性→退火→延伸）三步基本反应经多次循环而完成的（图4-8）。

（1）变性加热至90～96℃时，模板DNA双螺旋的氢键断裂，双链解链，形成单链DNA。

（2）退火当温度突然降低至25～65℃时，模板DNA与引物按碱基互补配对原则结合，此时也存在两条模板链之间的结合，但由于引物的高浓度、结构简单等特点，从而使主要的结合发生在模板与引物之间。

（3）延伸 70～74℃时，在TaqDNA聚合酶和4种脱氧核糖核苷三磷酸底物及Mg²⁺存在的条件下，以引物3′端为起始点沿着互补的单链模板进行DNA链延伸反应。以上三步为一个循环，每一个循环的产物可以作为下一个循环的模板。因此扩增产物的量以指数方式增加。通常经25～30次可扩增目的片段约10⁵倍，这个量足够分子生物学研究的一般要求。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）模板用合适方法制备模板DNA。

（2）引物DNA合成仪合成后，经纯化、定量，无菌去离子水或三蒸水配制成10～50μmol/L的溶液。

（3）TaqDNA聚合酶。

（4）dNTP。

（5）PCR反应缓冲液。

（6）1.0%琼脂糖。

（7）溴化乙锭（EB）10mg/mL。

图4-8 PCR反应原理

2.器材

PCR自动扩增仪；电泳仪、电泳槽；紫外检测仪；台式高速离心机；可调式移液枪及吸头（0.1～2.5μL、0.5～10μL、2～20μL）；离心管（0.2mL，0.5mL）。

【操作方法】

1.按顺序在0.5mL离心管中加入下列试剂：

①双蒸水　12.5μL

②PCR反应缓冲液　2.5μL

③dNTP　2μL

④引物A　2μL(www.chuimin.cn)

⑤引物B　2μL

⑥模板DNA　2μL

⑦TaqDNA聚合酶　2μL

Ti p头吸打数次混匀后稍离心。

2.PCR扩增

95℃-4min→［（95℃-30s，60℃-60s，72℃-60s）30个循环］→72℃-7min→4℃（保存）

3.取10μL PCR产物进行电泳鉴定。

【要点提示】

PCR方法操作简便，但影响因素较多，欲得到好的反应结果，需根据不同的DNA模板摸索最适条件。主要影响PCR结果的因素如下：

1.模板

单、双链DNA都可以作为PCR的模板，若起始材料是RNA，须通过逆转录得到第一条cDNA，以此为模板进行PCR。虽然PCR可以仅用极微量的样品（甚至是来自单一的细胞DNA），但是为了保证反应的特异性，一般推举使用纳克量级的克隆DNA、微克水平的染色体DNA或10⁴拷贝的待扩增片段来做起始材料。原料可以是粗制品，但不能混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，因此DNA样品纯度要尽可能地高。

2.退火温度

一般设定比理论t_m低5℃，一般提高退火温度会增加扩增的特异性。

3.对照实验

PCR灵敏度高，被检样品极易被污染，PCR实验主要存在以下几种污染：

（1）标本间交叉污染；

（2）PCR试剂的污染；

（3）PCR扩增产物污染；

（4）实验室中克隆质粒的污染；

（5）实验室中气溶胶的污染。

所以在进行PCR实验的时候一定要设置阴性对照实验。阴性对照实验的方法之一是不加入模板（用水代替），其他试剂应完全相同。

【思考题】

1.理论上，通过本次实验模板基因扩增了多少倍？