重组蛋白质的表达分离纯化与鉴定

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：（一）蛋白质的表达、分离、纯化了解重组蛋白表达的方法和意义。目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离、纯化及理论研究和实验应用都具有重要的意义。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

（一）蛋白质的表达、分离、纯化

【目的要求】

（1）了解重组蛋白表达的方法和意义。

（2）了解重组蛋白质和层析分离、纯化的方法。

【实验原理】

目的基因在宿主细胞中的高效表达及表达的重组蛋白的分离、纯化及理论研究和实验应用都具有重要的意义。通过表达能探索和研究基因的功能以及基因表达调控的机理，同时目的基因表达出编码的蛋白质可供科研工作者进行结构与功能的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统，其表达外源基因产物的水平远高于其他表达系统，表达的目的蛋白质甚至能超过细菌总蛋白量的80%。本实验中，携带有目的蛋白基因的质粒在大肠杆菌BL21（DE3）中，于37℃在异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）诱导下，超量表达携带有6个连续组氨酸残基的重组氯霉素酰基转移酶蛋白，该蛋白的N端带有6个连续的组氨酸残基，可通过固相化的镍离子（Ni²⁺）亲和层析介质加以分离、纯化，称为金属螯合亲和层析（MCAC）。蛋白质的纯化程度可通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分析。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）LB液体培养基胰化蛋白胨（trytone）10g，酵母提取物（yeast extract）5g，NaCl10g，用蒸馏水配至1000mL。

（2）氨苄青霉素 100mg/mL。

（3）上样缓冲液（GLB）100mmol/L NaH₂PO₄，10mmol/L Tris，8mol/L尿素，1mmol/Lβ-巯基乙醇，pH为8.0。

（4）清洗缓冲液（UWB）100mmol/L NaH₂PO₄，10mmol/L Tris，8mmol/L尿素，pH为6.3。

（5）洗脱缓冲液 100mmol/L NaH₂PO₄，10mmol/L Tris，8mmol/L尿素，500mmol/L咪唑，pH为8.0。

（6）异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）。

2.器材

摇床；高速离心机；层析柱（1cm×10cm）；蠕动泵。

【操作方法】

1.氯霉素酰基转移酶重组蛋白的诱导

（1）接种含有重组氯霉素酰基转移酶蛋白表达载体的大肠杆菌BL21（DE3）菌株于5mL LB液体培养基中（含100μg/mL氨苄青霉素），37℃下振荡培养过夜。

（2）转接1～5mL过夜培养物于100mL（含100μL/mL氨苄青霉素）LB液体培养基中，37℃下振荡培养至OD₆₀₀0.6～0.8。取1mL培养物用于SDS-PAEG分析。

（3）加入IPTG至终浓度0.5mmol/L，37℃下继续培养1～3h。

（4）用12000r/min离心5min，弃上澄清液，菌体沉淀保存于-20℃或-70℃的冰箱中

2.氯霉素酰基转移酶重组蛋白的分离、纯化

（1）Ni²⁺层析柱的准备在层析柱中加入1mL Ni²⁺介质，并分别用8mL去离子水、8mL上样缓冲液（GLB）洗涤。

（2）重组蛋白的变性裂解在冰浴中冻融菌体沉淀，加入5mL上样缓冲液，用吸管抽吸重悬，用振荡器轻柔地混匀样品60min，4℃或室温下用12000r/min离心30min，将上清液吸至一个干净的容器中，并弃沉淀。取10μL上清样品，用于SDS-PAGE分析。

（3）洗脱杂蛋白用清洗缓冲液（UWB）50mL以10～15mL/h流速洗涤层析柱，去除杂蛋白，直至OD₂₈₀为0.01，经过3～4h，取10μL洗涤结束时的样品，用于SDS-PAGE分析。

（4）洗脱目标蛋白用洗脱缓冲液10mL洗柱，按每管1mL分别收集洗脱液，共收集6～10管，分别取10μL样品，用于SDS-PAGE分析。

（二）蛋白质的鉴定

【实验目的】

（1）了解SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳实验原理。

（2）掌握凝胶电泳实验的操作方法。

【实验原理】(www.chuimin.cn)

电泳可用于分离复杂的蛋白混合物，研究蛋白质的亚基组成等。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶的孔径，蛋白质的电荷、大小、性质等因素共同决定了蛋白质的电泳迁移率。

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于它所带静电荷以及分子的大小和形状等因素。如果加入某种试剂使电荷因素消除，则电泳迁移率只取决于分子的大小，这样就可以用电泳技术测定蛋白质的相对分子质量。十二烷基硫酸钠（SDS）就是具有这种作用的试剂。在蛋白质溶液中加入足量的SDS和巯基乙醇可使蛋白质分子的二硫键还原，蛋白质-SDS复合物带上相同密度的负电荷，并可引起蛋白质构象改变，使蛋白质在凝胶中的迁移率不再受蛋白质原有电荷和形状的影响，而取决于相对分子质量的大小，因此聚丙烯酰胺凝胶电泳可以用于测定蛋白质的相对分子质量。

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳大多在不连续系统中进行，其电泳槽缓冲液的pH与离子强度不同于配胶缓冲液。该凝胶包括浓缩胶和分离胶两部分。当两电极间接接通电流后，凝胶中形成移动界面，并带动加入凝胶的样品中的SDS多肽复合物向前推进。样品通过高度多孔性的积成胶后，复合物在分离胶表面聚集成一条很薄的区带（或称积层）。由于不连续缓冲系统具有把样品中的复合物全部浓缩于极小体积的能力，从而大大提高了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率，使蛋白质各自的大小得到分离。

【试剂和器材】

1.试剂

（1）10%过硫酸铵（现用现配）。

（2）TEMED（商品试剂）。

（3）2×上样缓冲液在40mL水中加入1.52g Tris、20mL甘油、2.0g SDS、2.0mL2-巯基乙醇和1mg溴酚蓝，用1mol/L HCl定容至1000mL。

（4）5×Tris-甘氨酸电泳缓冲液 15.1g Tris，94g甘氨酸（电泳级），50mL10%SDS，定容至1000mL。

（5）考马斯亮蓝染液将0.25g考马斯亮蓝R-250溶于90mL甲醇∶水（1∶1）和10mL冰乙酸的混合液中。

（6）脱色液水∶乙酸∶乙醇=6.7∶0.8∶2.5。

2.器材

DYCZ-24D型垂直板电泳槽；微量注射器（10μL或50μL）；脱色摇床；移液管（1mL、5mL、10mL）；烧杯（25mL、50mL、100mL）；电泳仪；大培养皿；移液枪。

【操作方法】

1.SDS-聚丙烯酰胺凝胶的配置