亲和层析法纯化麦胚凝集素

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：亲和层析技术已成为纯化生物活性物质最重要的方法之一。然后从麦胚中分离提取麦胚凝集素粗提液。收集洗脱液，经透析、冷冻干燥成干粉即可得到麦胚凝集素纯品。实验结果证明，通过亲和层析技术，可以从麦胚的粗提液中直接得到有活性的麦胚凝集素纯品。图4-6 亲和层析纯化麦胚凝集素亲和柱洗脱液 0.5mol/L KCl-0.1mol/L pH2.5甲酸溶液。

【目的要求】

1.理解和掌握亲和层析的基本原理和操作技术。

2.通过实验能初步掌握制备一种亲和吸附剂的操作方法。

【实验原理】

亲和层析是利用生物分子与配基之间所具有的专一而又可逆的亲和力使生物分子分离纯化的技术。在生物分子间存在很多特异性的相互作用，如酶与底物或抑制剂、抗原与抗体、激素与激素受体、植物凝集素与某些多糖等，它们之间都能专一而可逆地结合，这种结合力就称为亲和力。亲和层析由于是按照生物分子和配体的特异性结合进行分离的，一般来说通过亲和层析，被分离物质的纯度有时一次即可提高几倍、几十倍甚至几百倍。亲和层析技术已成为纯化生物活性物质最重要的方法之一。

亲和层析的分离原理简单地说就是通过将具有亲和力的两个分子中的一个固定在不溶性基质上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子进行分离纯化。被固定在基质上的分子称为配基，配基和基质是共价结合的，构成亲和层析固定相，称为亲和吸附剂。实验时首先选择与待分离的生物分子有亲和力的物质作为配基，并将其共价结合在水不溶性基质（如Sepharose-4B）上制成亲和吸附剂，然后装柱，当样品溶液通过亲和层析柱时，绝大部分对配基没有亲和力的化合物均顺利地流过层析柱而不滞留，只有与配基互补的化合物被吸附留在柱内。当所有的杂质从柱上流走后，再改变洗脱条件，使结合在配基上的物质解离下来。

一、配基和载体的选择

1.配基的选择

（1）必须有与载体共价结合的化学基团。

（2）与被分离物质有较强的亲和力。

（3）与纯化的物质结合后能被解吸。

2.载体的选择

（1）具有疏松的多孔网状结构，较好的吸水性。

（2）具有较多的化学活性基团，能被有效地活化，而且容易与配基偶联。

（3）极低的非特异性吸附，理化性质稳定。

一般选择凝胶类层析介质，最常用的是Sepharose-4B，具有理想载体的特性。琼脂糖含有大量的羟基，容易被多种活化剂活化，并易引入各种适宜的活性团。

二、亲和吸附剂的制备

1.载体的活化与偶联配基

通过对载体进行一定的化学处理，使载体表面上的一些化学基团转变为易于和特定配基结合的活性基团。环氧氯丙烷活化载体是最常用的方法。这种方法活化后的载体都含有环氧乙基，可以结合含有氨基的配基，采用环氧氯丙烷为活化剂，Sepharose-4B为载体，鸡卵类黏蛋白为配基可合成适用于分离麦胚凝集素的亲和吸附剂。

2.引入“手臂”提高吸附剂的亲和力

层析过程中，如果配基直接与载体偶联，载体可占据配基分子表面的部分位置而影响结合，解决的方法是在载体和配基之间连接一段适当长度的有机小分子（己烷），称之为“手臂”，使载体上的配基离开载体的骨架向外延伸以增强配基的活动度和与被分离物质之间的接触面，提高对亲和吸附剂的结合效率。

麦胚凝集素是来自于小麦胚芽的一种蛋白质，可以可逆地与糖蛋白结合，凝集素名称的由来是它们通过与红细胞表面特异性受体结合可凝集各种类型的红细胞。本实验首先将载体琼脂糖凝胶4B活化，选择鸡卵类黏蛋白为配基，偶联在已经活化的载体上，制备成亲和吸附剂。然后从麦胚中分离提取麦胚凝集素粗提液。将其进行纯化。在pH7.6～8.0的条件下，麦胚凝集素能牢固地吸附在亲和吸附剂上，在pH2.5～3.0的条件下，又能从吸附剂上洗脱下来。收集洗脱液，经透析、冷冻干燥成干粉即可得到麦胚凝集素纯品。反应机制如图4-6所示。

实验结果证明，通过亲和层析技术，可以从麦胚的粗提液中直接得到有活性的麦胚凝集素纯品。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）0.5mol/L NaCl溶液。

（2）2mol/L NaOH溶液。

（3）0.2mol/L pH9.5 Na₂CO₃缓冲液。

（4）56%1，4-二氧六环（体积分数）。

（5）环氧氯丙烷。(www.chuimin.cn)

（6）琼脂糖凝胶（Sepharose-4B）。

（7）亲和柱平衡液 0.5mol/L KCl-0.05mol/L CaCl₂-0.1mol/L pH7.8Tris-HCl缓冲液。

图4-6 亲和层析纯化麦胚凝集素

（8）亲和柱洗脱液 0.5mol/L KCl-0.1mol/L pH2.5甲酸溶液。

2.器材

恒温水浴摇床；752紫外分光光度计；层析柱（10mm×150mm）；抽滤瓶（500mL）；蛋白紫外检测仪；玻璃烧结漏斗（G-3）；低速离心机；透析袋；贮液瓶（500mL）。

【操作方法】

1.亲和吸附剂的合成

（1）载体Sepharose-4B的活化将适量的Sepharose-4B于G-3玻璃烧结漏斗中抽干，称10g（湿重）Sepharose-4B，用100mL0.5mol/L NaCl溶液淋洗、抽干，再用100mL蒸馏水淋洗、抽干，转移到100mL三角瓶内。然后加入8mL2mol/L NaOH、2mL环氧氯丙烷、20mL56%1，4-二氧六环。在40℃的恒温水浴摇床中，160r/min振摇活化2h。然后转移到G-3玻璃烧结漏斗中，用蒸馏水洗去未反应的残留试剂，再用20mL0.2mol/L pH9.5Na₂CO₃缓冲液洗涤。抽干后转移到100mL三角瓶中准备偶联。

（2）配基鸡卵类黏蛋白的偶联称取100mg鸡卵类黏蛋白，用10mL0.2mol/L pH9.5Na₂CO₃缓冲液充分溶解，取0.1mL溶液稀释30倍，用紫外分光光度计在280nm处测定鸡卵类黏蛋白的含量。然后将稀释后的溶液全部转移到100mL三角瓶中与活化的Sepharose-4B混匀，在40℃恒温水浴摇床中，160r/min振摇偶联24h左右停止偶联。

（3）洗涤取一个洗净的500mL抽滤瓶，将已经偶联好的Sepharose-4B转移到G-3玻璃烧结漏斗中抽滤，用100mL0.5mol/L NaCl溶液洗去未被偶联的蛋白，收集滤液，并在280nm处测定滤液中剩余的鸡卵黏蛋白的含量。用100mL蒸馏水洗，再用50mL亲和柱洗脱液（pH2.5）淋洗，蒸馏水洗至中性（pH6.0）。然后转移到100mL烧杯内，加入50mL亲和柱平衡液（pH7.8），浸泡约15min，脱气后装柱或置4℃冰箱保存备用。

2.麦胚凝集素粗提液的制备

称取40g麦胚加入500mL烧杯中，加5倍体积的水，搅拌，置于40℃恒温水浴中浸提4h以上。4层纱布过滤。滤液3500r/min离心20min。将上清液pH调至5.0～5.5，然后置于60℃水浴中3～5min（此时出现大量明显絮状物）。3500r/min离心20min，上清液pH调至7.5即得麦胚凝集素粗提液，置冰箱内备用（检查对A型红血球的凝集现象）。

3.亲和层析纯化麦胚凝集素

（1）装柱选用10mm×150mm层析柱，垂直夹于铁架台上。柱内先装入1/4体积的亲和柱平衡液（pH7.8），将脱气的亲和吸附剂轻轻搅匀，一次装入柱内，待其自然沉降，调整流速为2～4mL/10min。用亲和柱平衡液（pH7.8）平衡约两个柱床体积，直至流出液在蛋白紫外检测仪上绘出稳定的基线。

（2）上样将麦胚凝集素粗提液3500r/min离心10min，取上清液上柱亲和层析。待样品全部入床后（注意检查流出液的凝集活性）用亲和柱平衡液平衡。

（3）洗脱待流出液在蛋白质检测仪上绘出稳定的基线以后，改用亲和柱洗脱液（pH2.5）洗脱。收集洗脱峰（图4-7）。

图4-7 麦胚凝集素亲和层析洗脱曲线

（4）透析待全部收集后，量体积，调pH7.5，装入透析袋内在低温下对蒸馏水透析，直至经1% AgNO₃检查无氯离子为止。然后经冷冻干燥成干粉即可。

【结果处理】

1.偶联率：1g Sepharose-4B偶联鸡卵类黏蛋白的毫克数。

2.亲和吸附率（mg/g）：1g亲和吸附剂结合麦胚凝集素的毫克数。

3.绘制亲和层析分离麦胚凝集素的层析图。

【要点提示】

1.在亲和层析分离纯化麦胚凝集素之前，将麦胚凝集素粗提取液调到pH7.5过滤后才能上样。若上样的麦胚凝集素是在酸性环境中，亲和吸附剂与麦胚凝集素不会发生结合。