植物中超氧化物歧化酶（SOD）分离纯化：实验5详解

【目的要求】

1.了解有机溶剂沉淀蛋白质以及纤维素离子交换柱层析方法的原理。

2.掌握测定超氧化物歧化酶活力和比活力的方法。

【实验原理】

（一）SOD的性质

超氧化物歧化酶（SOD），是一种生物活性蛋白质，是人体不可缺少的氧自由基清除剂，也是目前为止发现的唯一的以自由基为底物的酶。

SOD金属蛋白酶，对pH、热和蛋白酶水解等反应比一般酶稳定。

它广泛存在于各类生物体内，按其所含金属离子的不同，可分为3种：铜锌超氧化物歧化酶（Cu·Zn-SOD）、锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）和铁超氧化物歧化酶（Fe-SOD）。

SOD催化如下反应：

（二）SOD的分离提取

蛋白质包括酶的分离纯化方法很多，主要有：①根据蛋白质溶解度不同的分离方法，包括蛋白质的盐析、等电点沉淀法、低温有机溶剂沉淀法；②根据蛋白质分子大小的差别的分离方法，包括透析与超滤、凝胶过滤法；③根据蛋白质带电性质进行分离，包括电泳法、离子交换层析法。④根据配体特异性的分离方法——亲和色谱法。

1.酶的提取纯化

在分离制备时首先将植物细胞破碎，用提取液制备粗酶液。经加热变性、有机溶剂沉淀除去大量杂蛋白，再用DEAE-纤维素柱层析或DEAE-葡聚糖柱层析纯化，可得到更纯的酶。经过以上分离纯化步骤后，酶可提纯100倍以上。

大部分酶都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用水溶液提取、分离和纯化酶。稀盐和缓冲系统的水溶液对酶稳定性好、溶解度大，是提取酶最常用的溶剂，通常用量是原材料体积的1～5倍，提取时需要均匀地搅拌，以利于酶的溶解。提取的温度要视有效成分性质而定。一方面，多数酶的溶解度随着温度的升高而增大，因此，温度高利于溶解，缩短提取时间。但另一方面，温度升高会使酶变性失活，因此，基于这一点考虑提取酶时一般采用低温（5℃以下）操作。

由于SOD是金属酶，其金属离子对热有稳定的影响，所以SOD对热比较稳定。一般情况下，SOD表现出短时间的耐热性能。据资料报道当反应温度为88℃，时间为15～30min时对酶活力的影响不大，而一般杂蛋白在55℃以上时就容易变性。因此，采用热击变性法对粗酶进行处理，以除去一部分杂蛋白。

极性有机溶剂能引起蛋白质脱去水化层，并降低介电常数而增加带电质点间的相互作用，致使蛋白质颗粒凝集而沉淀。采用这种方法沉淀蛋白质时，要求在低温下操作，并且需要尽量缩短处理时间，避免蛋白质变性。为此选用低温有机溶剂沉淀法进一步纯化酶。

Cu·Zn-SOD的pI为6.8，将上一步收集的SOD丙酮沉淀物溶于蒸馏水中，在pH7.8的条件下，Cu·Zn-SOD带负电，过DEAE-32纤维素阴离子交换柱可得到进一步纯化。

离子交换层析是依据各种离子或离子化合物与离子交换剂的结合力不同而进行分离纯化的。离子交换层析的固定相是离子交换剂，它是由一类不溶于水的惰性高分子聚合物基质通过一定的化学反应共价结合某种电荷基团形成的。离子交换剂可以分为三部分：高分子聚合物基质、电荷基团和平衡离子。电荷基团与高分子聚合物共价结合，形成一个带电的可进行离子交换的基团。平衡离子是结合于电荷基团上的相反离子，它能与溶液中其他的离子基团发生可逆的交换反应。平衡离子带正电的离子交换剂能与带正电的离子基团发生交换作用，称为阳离子交换剂；平衡离子带负电的离子交换剂与带负电的离子基团发生交换作用，称为阴离子交换剂。

离子交换剂有阳离子交换剂（如羧甲基纤维素、CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素、DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后可通过改变pH或离子强度将吸附的蛋白质洗脱下来。

离子交换柱层析基本装置及操作方法如下。

（1）柱层析的基本装置 柱层析的基本装置如图4-4所示。

图4-4 柱层析的基本装置示意图

（2）柱层析的基本操作 柱层析的基本操作包括以下一些步骤。

①装柱。柱子装得质量好与差，是柱层析法能否成功分离、纯化物质的关键步骤之一。一般要求柱子装得要均匀，不能分层，柱子中不能有气泡等。否则要重新装柱。

首先选好柱子，根据层析的基质和分离目的而定。一般柱子的直径与长度比为1∶（10～50），凝胶柱可以选1∶（100～200），同时将柱子洗涤干净。

将层析用的基质（如吸附剂、树脂、凝胶等）在适当的溶剂或缓冲液中溶胀，加适量1mol/L NaOH溶液，搅匀后放置15min，用G3烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼悬浮于1mol/L HCl溶液中，搅匀后放置10min后用G3烧结漏斗抽滤，水洗至中性，滤饼再悬浮于1mol/L NaOH溶液中，抽滤，水洗至中性，并真空抽气（吸附剂等与溶液混合在一起），以除去其内部的气泡。最后将滤饼悬浮于层析柱平衡缓冲液中待用。

关闭层析柱出水口，并装入1/3柱高的缓冲液，并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中，使其沉降约3cm高。

打开出水口，控制适当流速，使吸附剂等均匀沉降，并不断加入吸附剂溶液（吸附剂的多少根据分离样品的多少而定）。注意不能干柱、分层，否则必须重新装柱。

最后使柱中基质表面平坦并在表面上留有2～3cm高的缓冲液，同时关闭出水口（可采用机械化装柱法）。

②平衡。柱子装好后，要用pH7.8，2.5mmol/L磷酸钠缓冲液作层析柱平衡液平衡柱子。用恒流泵在恒定压力下走柱子（平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同）。平衡液体积一般为3～5倍柱床体积，以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。

③加样。加样量的多少直接影响分离的效果。一般讲，加样量尽量少些，分离效果比较好。通常加样量应少于20%的操作容量，体积应低于5%的床体积，对于分析性柱层析，一般不超过床体积的1%。当然，最大加样量必须在具体条件下多次试验后才能决定。

应注意的是，加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面，尽量避免冲击基质，以保持基质表面平坦。

④洗脱、收集、鉴定。洗脱条件的选择，也是影响层析效果的重要因素。当选定好洗脱液后，洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。

简单洗脱：柱子始终用同一种溶剂洗脱，直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲和力差异不大，其区带的洗脱时间间隔（或洗脱体积间隔）也不长，采用这种方法是适宜的。但选择的溶剂必须很合适方能使各组分的分配系数较大。否则应采用下面的方法。

分步洗脱：这种方法是对按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液，进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。

梯度洗脱：当混合物中组分复杂且性质差异较小时，一般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的，梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH等。最常用的是浓度梯度。在水溶液中，也采用离子强度梯度。

当对所分离的混合物的性质了解较少时，一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试，但梯度的斜率要小一些，尽管洗脱时间较长，但对性质相近的组分分离更为有利。

同时还应注意洗脱时的速率。前面我们已经谈到，流速的快慢将影响理论塔板高度，从而影响分辨率。事实上，速度太快，各组分在固液两相中平衡时间短，相互分不开，仍以混合组分流出。速度太慢，将增大物质的扩散，同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的流速。总之，必须经过反复的试验与调整（可以用正交试验或优选法），才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是，在整个洗脱过程中，千万不能干柱，否则分离纯化将会前功尽弃。

在生化实验中，基本上都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。由于检测系统的分辨率有限，洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此，每管的收集量不能太多，一般1～5mL/管。如果分离的物质性质很相近，可低至0.5mL/管。在合并一个峰的各管溶液之前，还要进行鉴定。例如，一个蛋白峰的各管溶液，要先用电泳法对各管进行鉴定。对于是单条带的，认为已达电泳纯，合并在一起。其他的另行处理。对于不同种类的物质采用相应的鉴定方法，在这里不再叙述。最后，为了保持所得产品的稳定性与生物活性，我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩，再冰冻干燥，得到干粉，在低温下保存备用。

用pH7.8，2mmol/L（100mL）～200mmol/L（100mL）的磷酸钠缓冲液进行梯度洗脱。流速1mL/min，每管收集3mL。测定洗脱液的蛋白质含量和酶活，并绘制曲线（图4-5）（用紫外分光光度计测各管的OD₂₈₀，OD₂₈₀数值高的管进行酶活力测定）。

图4-5 蛋白含量、酶活力与管数的关系

⑤基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）的再生。许多基质（吸附剂、交换树脂或凝胶等）可以反复使用多次，而且价格昂贵，所以层析后要回收处理，以备再用，严禁乱倒乱扔。

2.植物组织SOD活性测定

超氧化物歧化酶活力测定的方法有多种，其中以化学法应用O·^2-最为普遍。化学测定法包括两个方面：一方面是产生超氧自由基，如黄嘌呤氧化酶起作用时会产生O·^2-，肾上腺素自氧化和邻苯三酚在碱性条件下自氧化都会产生O·^2-；另一方面是对O·^2-的检测，多数是利用反应液中能与O·^2-起作用，并易于被检测的指示物质的浓度变化来测定SOD活性。常用的方法有：黄嘌呤-黄嘌呤氧化酶-细胞色素C法、邻苯三酚自氧化法、超氧化钾直接滴定法、氯化硝基氮蓝四唑-核黄素法。(www.chuimin.cn)

3.分析方法

蛋白质含量测定：采用紫外吸收法。

酶纯度用比活力表示：比活力=酶活/蛋白质含量。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）圆葱。

（2）硫酸钠（1%）、硝酸钠（1%）、三氯乙酸（0.5%）、乙醇（5%）、无水碳酸钠、NaOH、CuSO₄、酒石酸钠钾、磷酸溶液、浓盐酸。NaOH标准溶液、标准牛血清蛋白、Na₂HPO₄·12H₂O、NaH₂PO₄·2H₂O、邻苯三酚、丙酮（0.5%）、0.5mmol/L NaCl、1mol/L HCl溶液、1mol/L NaOH溶液、DEAE纤维素粉。

（3）溶剂配制

①50mmol/L PBS溶液（pH7.8）。a.取17.9070g Na₂HPO₄·12H₂O定容至1000mL；b.取1.9501g NaH₂PO₄·2H₂O定容至250mL；用b.滴定a.至pH7.8，即为50mmol/L磷酸缓冲溶液。

②50mmol/L的邻苯三酚。6.3g邻苯三酚溶于1L蒸馏水中。

③1mg/mL标准牛血清蛋白。准确称取0.05g牛血清蛋白定容至50mL。

④pH7.8，200mmol/L的磷酸钠缓冲液。

2.器材

高速组织捣拌机、电热鼓风干燥箱、离心机、pH计、恒温水浴锅、天平、可见分光光度计、核酸蛋白仪、紫外可见分光光度计、层析柱。

【操作方法】

（一）酶的制备

1.粗酶液的提取

将圆葱切至3cm左右见方的小块，放入研钵中，捣3～5min使其破碎，以0.5倍的0.5mmol/L NaCl于4℃下浸泡过夜。然后4000r/min离心20min，弃去沉淀，留取上清液，即为SOD抽提液，留样5mL测定其酶活和蛋白质含量。

注意：离心管相对位置应配平。

2.热变性

将粗酶液在55℃下处理30min，然后离心，4000r/min20min，弃去沉淀，留取上清液，留样5mL测定其酶活和蛋白质含量。

3.丙酮分级沉淀

取经热击处理后的上清液，缓慢加入0.4倍冷丙酮（体积比），然后在冰浴条件下搅拌，冰浴2h。4000r/min离心20min，弃去上清液，沉淀用5倍2.5mmol/L的磷酸缓冲溶液溶解，留样2mL测定其酶活和蛋白质含量（此时去除杂蛋白的效果最好）。

4.DEAE-纤维素柱层析

取经过丙酮沉淀后溶解的上清液，稀释10倍，过DEAE-纤维素柱（2.6mm×40mm）。先用2.5mmol/L pH7.8磷酸缓冲溶液平衡3～4个床体积，上样量为1mL，继续用2.5mmol/L pH7.8磷酸缓冲溶液冲洗120mL，然后再分别用60mL50～250mmol/L（50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L、250mmol/L）pH7.8的磷酸缓冲液梯度洗脱，流速为0.6mL/min。核酸蛋白仪检测波长280nm，收集有活性的部分，量取体积，测定蛋白质含量和酶活力。留取少量溶液备用。

（二）酶活力的测定

1.活力的测定

邻苯三酚自氧化法：加入待测SOD样液10μL，然后在25℃水浴保温10min，最后加入50mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入1cm比色杯，在320nm下每隔30s测一次光密度，共测4min。此时邻苯三酚自氧化速率记做ΔA（A/min），邻苯三酚自氧化速率在4min内有效，控制SOD浓度，使邻苯三酚自氧化速率降至0.035（A/min）附近。

2.酶活力的计算

1mL反应液中每分钟抑制邻苯三酚自氧化速率达50%时的酶量定为一个酶活力单位。其SOD活力可由下式计算：

酶活力（U）=［（0.07-ΔA）/0.07×100%］/50%×反应液总体积×（样液稀释倍数/样液体积）

（三）蛋白质浓度测定——紫外吸收法

1.制备法标准曲线

按照表4-3分别在以下8个试管中加入标准蛋白溶液、蒸馏水、不同蛋白质浓度的样品后，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的吸光值A₂₈₀值，以A₂₈₀值为纵坐标，标准蛋白含浓度为横坐标，绘制标准曲线。

表4-3 蛋白质标准曲线绘制

2.样品蛋白质浓度测定

取待测蛋白质溶液1mL，加入3mL蒸馏水，摇匀，按上述方法在280nm波长处分别测定各管溶液的A₂₈₀值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。如果待测液被稀释，则未知蛋白浓度按下列公式计算：

蛋白质（g/mL）=酶液稀释倍数×100×A₂₈₀/测定的稀释酶液的体积

【结果处理】

总活力和收率按下列公式计算，将结果添于表4-4中。

总活力（U）=SOD活力×原液总体积

表4-4 SOD的分离纯化结果表