SDS-PAGE法快速测定蛋白质分子量

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠，则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和形状无关，因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量。因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质相对分子质量的大小。标准蛋白质相对分子质量见表4-1。②待测蛋白质样品的处理。

【目的要求】

1.了解SDS-PAGE垂直板电泳法的基本原理。

2.掌握SDS-PAGE法测定蛋白质相对分子质量的技术。

【实验原理】

聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）在加速剂四甲基乙二胺（TEMED）和催化剂过硫酸铵（AP）共同作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。

蛋白质在PAGE时，它的迁移率取决于它所带净电荷以及分子的大小和形状等因素。如果在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子质量，而与所带电荷和形状无关，因此可以利用SDS-PAGE测定蛋白质相对分子质量。

SDS是一种阴离子去污剂，能够破坏蛋白质分子内和分子间的氢键，使蛋白质变性而改变其原有的构象，并同蛋白质分子充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS复合物。强还原剂巯基乙醇可以打开蛋白质分子内的二硫键使这种结合更加充分。一定量的SDS与蛋白质分子结合后，所带负电荷的量远远超过了蛋白质原有的净电荷，从而消除了不同种蛋白质之间所带净电荷的差异。因此，在电泳过程中，迁移率仅取决于蛋白质-SDS复合物的大小，也可以说是取决于蛋白质相对分子质量的大小。当蛋白质相对分子质量在15000～200000之间时，样品的迁移率与其相对分子质量的对数呈线性关系，符合下列方程：

lgM_r=K-bm_r

式中 M_r——蛋白质的相对分子质量；

K——常数；

b——斜率；

m_r——相对迁移率。

在条件一定时，b和K均为常数。

将已知相对分子质量的标准蛋白质的迁移率对相对分子质量的对数作图，可获得一条标准曲线（图4-2所示）。未知蛋白质在相同条件下进行电泳，根据它的电泳迁移率即可在标准曲线上求得相对分子质量。

图4-2 蛋白质的相对分子质量与相对迁移率的关系

【试剂与器材】

1.试剂

（1）标准蛋白质根据待测蛋白质的相对分子质量大小，选择6种已知相对分子质量的蛋白质纯品作为标准蛋白质（marker）。标准蛋白质相对分子质量见表4-1。

表4-1 标准蛋白质的相对分子质量

续表

（2）1%（体积分数）TEMED溶液取1mL TEMED，加蒸馏水至100mL，置棕色瓶中，4℃冰箱中保存。

（3）10%（质量浓度）过硫酸铵溶液（AP）取过硫酸铵1g，溶解于10mL蒸馏水中。现配现用。

（4）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲溶液称取Tris0.6g，加入50mL蒸馏水使之溶解，再加入3mL1mol/L HCl溶液，混匀后用pH计调pH至8.0，最后加蒸馏水至100mL。

（5）蛋白质样品溶解液 SDS100mg，巯基乙醇0.1mL，甘油1.0mL，溴酚蓝2mg，Tris-HCl缓冲溶液2mL，加蒸馏水至总体积10mL。

（6）分离胶缓冲溶液 Tris36.3g，加入1mol/L HCl溶液48mL，再加入蒸馏水定容至100mL，pH8.9。

（7）浓缩胶缓冲溶液 Tris5.98g，加1mol/L HCl溶液48mL，加蒸馏水至100mL，pH6.7。

（8）凝胶贮液丙烯酰胺（Acr）30.0g，Bis0.8g，加蒸馏水至100mL。

（9）10%SDS溶液将1g SDS溶于10mL蒸馏水中，50℃水浴加热。

（10）电极缓冲溶液取SDS1g，Tris6g，甘氨酸（Gly）28.8g，加蒸馏水至1000mL，pH8.3。

（11）固定液取50%甲醇454mL，冰醋酸46mL，混匀。

（12）染色液 1.25g考马斯亮蓝R-250，加454mL50%甲醇溶液和46mL冰醋酸，混匀。

（13）脱色液取冰醋酸75mL，甲醇50mL，加蒸馏水875mL。

2.器材(www.chuimin.cn)

迷你双垂直板电泳槽；PE手套；白瓷盘；电磁炉；直流稳压电源；移液枪及吸头；微波炉；大培养皿。

【操作方法】

1.安装双垂直板电泳槽

双垂直板电泳装置（图4-3），主要由装有铂丝电极的主体、上盖、下槽组成。附带有制备凝胶的原位制胶器、玻璃板、梳子、凝胶密封垫、单胶替代板、楔形板等。

图4-3 迷你双垂直板电泳槽

（1）用洗洁精浸透海绵擦洗玻璃板，然后用自来水冲洗，晾干。

（2）将长、短玻璃板组成的制胶板放入电极主体两侧，短玻璃板在内侧，用楔形板压好。

（3）将已插好玻璃板的电极主体平放在底座上，选择不同的厚度（1.0mm和1.5mm），双手同时用力拧紧底座上的塑料手柄。

（4）检测制胶板是否漏水，在玻璃板下端与硅胶密封垫交界的缝隙加入融化的1%琼脂。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡。

2.凝胶的制备

（1）分离胶的制备根据所测蛋白质的相对分子质量范围，选择某一合适的分离胶浓度。按表4-2所列的试剂用量配制分离胶和浓缩胶。

表4-2 SDS-不连续系统不同浓度凝胶配制用量表

将制备的分离胶溶液沿着凝胶的长玻璃片的内面加至长、短玻璃板间的窄缝内，用1mL注射器或移液枪沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水（用于隔绝空气，使胶面平整）。约1h分离胶完全聚合，用窄滤纸条吸去残留的水。

（2）浓缩胶的制备按表4-2配制浓缩胶，将凝胶溶液加到已聚合的分离胶上方，直至距短玻璃片上缘0.5cm处，轻轻将“梳子”插入浓缩胶内（插入“梳子”的目的是使胶液聚合后，在凝胶顶部形成数个相互隔开的凹槽）。在胶面上加入蒸馏水，30～60min后浓缩胶聚合，再放置30min。垂直胶面小心拔去“梳子”，放出蒸馏水，将pH8.3的电极缓冲溶液倒入内、外槽中，内槽液面应没过短板。

（3）蛋白质样品的处理

①标准蛋白质样品的处理。将marker开封后分装于50个离心管中备用。

②待测蛋白质样品的处理。称待测蛋白质样品1mg，按1mg/mL溶液比例加入样品溶解液，然后将其转移到离心管中，盖上盖子，在沸水浴中加热3min，取出冷至室温后加样。如待测样品已在溶液中，可先配制“浓样品溶解液”（各种溶质的浓度均比“样品溶解液”高1倍），将待测液与“浓样品溶解液”等体积混匀，然后同上加热。

（4）加样用移液枪分别取10μL待测样品液，小心将样品加到凝胶凹形样品槽底部。标准蛋白marker5μL加到正中央的凹槽中，待测蛋白样品分别加到左、右两边的凹槽中，做好标记。

（5）电泳将电泳仪的正、负极分别与电泳槽的正、负极连接，打开电泳仪开关，选择恒流，将电流控制在15～20mA，待样品进入分离胶后，电流调到30～50mA。当溴酚蓝染料距硅胶框1cm时，停止电泳，关闭电源。

（6）剥胶与固定电泳结束后，取下楔形板，拿出凝胶板，用移液枪的枪头轻轻撬动短玻璃板，将胶与玻璃板分开，凝胶板切下一角作为加样标记，然后用移液枪在胶与玻璃板之间注入1mL蒸馏水，凝胶板滑入白瓷盘或大培养皿内，加入固定液，固定2h或过夜。

（7）染色与脱色倾出固定液，加入染色液，染色2～4h。染色完毕，倾出染色液，用蒸馏水将胶面漂洗数次，然后加入脱色液。数小时换一次脱色液，直至蛋白质区带清晰为止。

【结果处理】

将大培养皿放在一张坐标纸上，量出加样端距细铜丝间的距离（cm）以及蛋白质样品区带中心与加样端的距离，按下式计算：

相对迁移率（m_r）=样品距加样端迁移距离（cm）/染料距加样端迁移距离（cm）

以标准蛋白质相对分子质量的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线（如图4-2所示）。根据未知样品相对迁移率可直接在标准曲线上查出其相对分子质量。

【要点提示】

1.灌胶时不能有气泡，以免电泳时影响电流的通过。

2.加样槽内不能有气泡，如有气泡，可用注射器针头挑除。

3.凝胶浓度的选择：根据待测样品估计的相对分子质量，选择凝胶浓度。相对分子质量在25000～200000的蛋白质选用终浓度为5%的凝胶；相对分子质量10000～70000的蛋白质选用15%的凝胶；在此范围内样品的相对分子质量的对数与迁移率呈直线关系。

【思考题】

1.在样品溶解液中SDS、巯基乙醇、甘油及溴酚蓝的作用分别是什么？

2.在SDS-PAGE中，分离胶与浓缩胶中均含有TEMED和AP，试述其作用。

SDS-PAGE法快速测定蛋白质分子量

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