凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：该法广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的相对分子质量也是它的重要应用之一。K a v是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质相对分子质量的一个依据。以蛋白质相对分子质量的对数lgMr为纵坐标，Ve为横坐标绘制标准曲线。

【目的要求】

1.了解凝胶层析的基本原理及其应用。

2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。

【实验原理】

凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶对混合物中各组分按分子大小不同进行分离的层析技术。该法广泛应用于分离、提纯、浓缩生物大分子及脱盐、去热源等，而测定蛋白质的相对分子质量也是它的重要应用之一。

凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状颗粒物质，每个颗粒的结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质的混合物样品加到用此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先从柱中流出；而小分子物质通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，移动速度慢，最后流出柱外。一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0～100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数（K_{a v}）（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，K_av值的大小和凝胶柱床的总体积（V_t）、外水体积（V_o）以及分离物本身的洗脱体积（V_e）有关：

在限定的层析条件下，V_e和V_o都是恒定值，而V_e随着分离物相对分子质量的变化而改变。相对分子质量大，V_e值小，K_av值也小。反之，相对分子质量小V_e值大，K_av值大。

外水体积V_o是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积，一般常用蓝色葡聚糖-2000作为测定外水体积的物质。柱床体积V_t是凝胶柱所能容纳的总体积。可用下式计算：

V _t=π×（D/2）×h

式中 π——常数3.14；

D——柱直径；

h——凝胶床的高度。

也可加入一定量的水至层析柱预定标记处，然后测量水的体积。洗脱体积V_e是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗脱液的体积。它包括自加入样品时算起，到组分最大浓度出现（洗脱峰尖）时所流出的体积。V_e一般是介于V_o和V_t之间的。对于完全排阻的大分子由于其不进入凝胶颗粒内，故其洗脱体积V_e=V_o。对于完全渗透的小分子由于它可以存在于凝胶柱整个体积内，故其洗脱体积V_e=V_t。相对分子质量介于二者之间的分子，它们的洗脱体积也介于二者之间。

K _{a v}是判断分离效果的一个重要参数，同时也是测定蛋白质相对分子质量的一个依据。在相同层析条件下，被分离物质K_{a v}值差异越大，分离效果越好。反之，分离效果差或根本不能分开。在实际的实验中，我们可以实测出V_t、V_o及V_e的值，从而计算出K_{a v}的大小。对于某一特定型号的凝胶，在一定的相对分子质量范围内，K_av与lgM_r呈线性关系：

K _av=-blgM_r+c

其中b，c为常数。

同样可以得到：

V _e=-b′lgM_r+c′

其中b′、c′为常数。即V_e与lgM_r也呈线性关系。我们可以通过在一凝胶柱上分离多种已知相对分子质量的蛋白质后，并根据上述的线性关系绘出标准曲线，然后用同一凝胶柱测出其他未知蛋白的相对分子质量。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）标准蛋白质混合液（2～3mg/mL KCl-乙酸溶液配制），牛血清白蛋白（相对分子质量67000），鸡卵白蛋白（相对分子质量43000），胰凝乳蛋白酶原A（相对分子质量25000）和溶菌酶（相对分子质量14300）。

（2）0.025mol/L KCl-0.2mol/L乙酸溶液（洗脱液）。

（3）2mg/mL蓝色葡聚糖-2000，配成质量浓度为2g/L的溶液。

（4）Sephadex G-75。

2.器材

层析柱（1.1cm×100cm）；核酸蛋白检测仪；贮液瓶；电磁炉；铁架台；记录仪；烧杯。

【操作方法】

1.凝胶的处理

称取7g Sephadex G-75干粉于250mL烧杯中，加入洗脱液100mL，置室温溶胀24h，然后于沸水浴中煮沸1～2h。冷却后用真空干燥器抽尽凝胶中的空气。(www.chuimin.cn)

2.装柱与平衡

（1）取洁净的玻璃层析柱垂直固定在铁架台上。

（2）凝胶柱总体积（V_t）的测定，在距柱上端约5cm处做一记号，关闭柱出水口，加入水，待液面降至柱记号处即关闭出水口，然后用量筒接收柱中水（水面降至层析柱玻璃筛板），读出的体积即为柱床总体积V_t。也可最后走完未知蛋白后再测定V_t。

（3）在柱内加入约1/4柱床高度的洗脱液，然后在搅拌下，将浓浆状的凝胶连续地倾入柱中，使之自然沉降，待凝胶沉降2～3cm后打开出水口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，至待沉集的胶面上升到柱记号处则装柱完毕。

（4）用眼睛观察柱内凝胶是否均匀，有无“纹路”或气泡。若层析柱床不均一，必须重新装柱。

（5）柱装好后，将柱上端接口与贮液瓶连接，用2～3倍体积的洗脱液平衡层析柱，使柱床稳定。

3.V_o的测定

（1）用滴管吸去柱上端的洗脱液，打开出水口，使残余液体降至与胶面相切时立即关闭出水口。

（2）用滴管吸取0.5mL蓝色葡聚糖-2000溶液，小心地绕柱壁一圈（距胶面2mm）缓慢加入，再打开出水口（开始收集），待溶液完全渗入柱床后，用少量洗脱液小心沿管壁洗柱1～2次，然后在柱上端加入3～4cm高度洗脱液。

（3）将柱上端接口与贮液瓶连接，柱出口端与核酸蛋白检测仪比色池进液口连接（下管），以3mL/10min流速开始洗脱。收集并测量从加样开始至洗脱液中蓝色葡聚糖-2000浓度最高点（峰尖）洗脱液体积，该数值即为V_o。

4.标准曲线的绘制

（1）按上述测定V_o的操作加入1mL标准蛋白混合液，以3mL/10min流速洗脱并收集。

（2）根据洗脱峰位置，分别测量各标准蛋白质洗脱峰最高点的洗脱液体积（V_e）。

（3）以蛋白质相对分子质量的对数lgM_r为纵坐标，V_e为横坐标绘制标准曲线。

（4）以蛋白质相对分子质量的对数lgM_r为纵坐标，K_av为横坐标绘制标准曲线。

5.未知样品相对分子质量的测定

完全按照标准曲线的条件操作。根据紫外检测的洗脱峰位置，收集并测量待测蛋白样品洗脱体积V_e。也可以代入公式计算出K_{a v}，分别由标准曲线查得其样品的相对分子质量。

【结果处理】

1.绘制蓝色葡聚糖-2000洗脱曲线。

2.绘制标准蛋白质洗脱曲线。

3.绘制待测蛋白样品洗脱曲线。

4.绘制lgM_r-K_av标准曲线，确定待测蛋白样品相对分子质量。

【要点提示】

1.各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液。操作过程中，层析柱内液面不断下降，则表示整个系统有漏气之处，应仔细检查并加以纠正。

2.装柱要均匀，流速不宜过快，避免因此而压紧凝胶。但也不宜过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降。

3.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡，影响液体在柱内的流动，导致分离效果变坏，不得不重新装柱。

4.洗脱用的液体应与凝胶溶胀所用液体相同，否则，由于更换溶剂引起容积变化，从而影响分离效果。

【思考题】

1.生化实验中常用的凝胶有哪些种类？各有何特点？

2.凝胶层析除用于测定蛋白质相对分子质量外，还有何用途？

凝胶过滤层析法测定蛋白质分子量

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