鸡卵类黏蛋白的分离与纯化实验->鸡卵类黏蛋白的分离与纯化

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：选择合适的pH及适当浓度的三氯乙酸或丙酮，可以从蛋清中除去大量的非卵类黏蛋白，获得鸡卵类黏蛋白的粗提液。初步纯化的鸡卵类黏蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白，得到鸡卵类黏蛋白的纯溶液。鸡卵类黏蛋白在280nm处的消光系数=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A280=0.413，据此可以测定鸡卵类黏蛋白的含量。将收集的蛋白液体放置冰箱，准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。

【目的要求】

1.掌握从鸡蛋清中提取鸡卵类黏蛋白的原理及方法。

2.了解凝胶过滤层析、离子交换层析的工作原理和操作技术。

3.掌握紫外吸收法测定蛋白质含量的原理及计算方法。

【实验原理】

鸡卵类黏蛋白是由鸡蛋清中提取的一种糖蛋白，可强烈地抑制胰蛋白酶，常用于胰蛋白酶学性质的研究，也可将其制成亲和吸附剂，通过亲和层析技术有效地分离与纯化胰蛋白酶。

鸡卵类黏蛋白在中性或酸性溶液中对热及高浓度的脲、有机溶剂都相当稳定，而在碱性溶液中不稳定，尤其是当温度较高时会迅速失活。它在10%三氯乙酸或50%丙酮溶液中有较好的溶解度。选择合适的pH及适当浓度的三氯乙酸或丙酮，可以从蛋清中除去大量的非卵类黏蛋白，获得鸡卵类黏蛋白的粗提液。

含盐或其他小分子的蛋白质混合溶液，在经过凝胶层析柱时，大分子蛋白质不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙以较快的速度最先流出柱外，而相对分子质量较低的盐或其他小分子物质则可以进入凝胶内部的微孔中，所以向下移动的速度较慢而最后流出柱外。这样鸡卵类黏蛋白粗提液经过凝胶柱层析后可以除去小分子物质（盐）而得到初步纯化。

初步纯化的鸡卵类黏蛋白，经DEAE-纤维素离子交换柱进一步纯化，可除去少量的杂蛋白，得到鸡卵类黏蛋白的纯溶液。

本实验先将鸡蛋清用三氯乙酸溶液处理，离心后去除沉淀物，然后由丙酮分级沉淀获得粗品，经Sephadex G-25柱层析脱盐，DEAE-纤维素离子交换柱层析纯化，再经透析及丙酮沉淀进一步纯化，最后真空干燥可得到鸡卵类黏蛋白合格产品。

鸡卵类黏蛋白在280nm处的消光系数=4.13，即蛋白质浓度为1mg/mL时溶液的吸光度A₂₈₀=0.413，据此可以测定鸡卵类黏蛋白的含量。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）丙酮。

（2）新鲜鸡蛋。

（3）0.5mol/L HCl溶液。

（4）Sephadex G-25。

（5）DEAE-纤维素粉。

（6）10% pH1.15三氯乙酸（TCA）将称取的三氯乙酸置烧杯内，加入2/3体积的蒸馏水溶解，用6mol/L NaOH调至约pH1.15，静置约1h，然后在pH计上校正至pH1.15，最后补充水到所配体积。

（7）0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液。

（8）0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液。

（9）0.3mol/L NaCl-0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液。

2.器材

恒温水浴锅；752紫外分光光度计；低速离心机；pH酸度计；核酸蛋白质检测仪；真空干燥器；烧结漏斗（G-3）；抽滤瓶；层析柱（25mm×300mm，15mm×200mm）；布氏漏斗（80mm）；电磁炉；不锈钢锅；透析袋；离心管；贮液瓶。

【操作方法】

1.鸡卵类黏蛋白的提取

（1）取1个鸡蛋清，加入等体积的10% pH1.15三氯乙酸溶液，这时出现大量白色沉淀，充分搅匀后，此时溶液的pH应是3.5±0.2，若偏离此值，用5mol/L NaOH或5mol/L HCl调至pH3.5。继续搅拌10min，室温下静置4h以上。

（2）4000r/min离心10min。收集上清液，再用滤纸过滤，除去上清液中脂类物质及其他不溶物。收集滤液转入100mL烧杯内。检查滤液的pH是否为3.5，否则要调到pH3.5。然后缓慢加入3倍体积预冷的丙酮，用玻璃棒搅匀并用保鲜膜封严，冰浴放置2～4h。

（3）待鸡卵类黏蛋白完全沉淀后，小心虹吸出部分上清液，剩余浑浊液转移到离心管中，3500r/min离心10min，弃去上清液，将有沉淀的离心管置于真空干燥器内。抽气，除去残留丙酮。

（4）将离心管中鸡卵黏蛋白加20mL蒸馏水，玻璃棒搅拌溶解，滤纸过滤除去不溶物。将滤液用Sephadex G-25层析柱脱盐或透析袋除盐。

2.Sephadex G-25柱层析脱盐

（1）凝胶的处理量取100mL Sephadex G-25（已溶胀好）加入到250mL烧杯中，加入200mL0.02mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液，于沸水浴中加热1h。冷却后用真空干燥器脱气。(www.chuimin.cn)

（2）装柱选用25mm×300mm层析柱，垂直夹于铁架台上。关闭层析柱出水口，然后在搅拌下将浆状的凝胶缓缓地倾入柱中，使之自然沉降，打开柱出水口，调节合适流速，使凝胶继续沉集。待沉集的胶面上升至距柱上口3～5cm时关闭层析柱出水口。

（3）平衡打开核酸蛋白检测仪及记录仪电源开关。将贮液瓶中加入0.02mol/L，pH6.5的磷酸盐缓冲液，与层析柱上端接口连接。再将层析柱出水口与核酸蛋白检测仪比色池进液口相连（下口）。开启柱出水口夹子，调节流速2mL/min，用约2倍体积的缓冲液平衡。流出液在核酸蛋白检测仪上绘出稳定的基线即可上样。

（4）上样关闭柱上、下口夹子，用滴管小心吸出层析柱上层液体。打开柱出水口，使残余液体降至与胶面相切，立即关闭出水口。吸取蛋白提取液在距离床面1mm处沿柱内壁轻轻转动加到凝胶床表面，打开出水口夹子，调节流速15滴/min，使样品流入凝胶床内，直到与胶面相切，立即用1mL0.02mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液冲洗柱壁，使其缓慢进入凝胶床内，然后在胶面上端加入3～4cm洗脱液，并将上端接口与贮液瓶连接。

（5）洗脱控制流速15滴/min，开始洗脱，在检测仪上观察到开始出峰时开始收集。将收集的蛋白液体放置冰箱，准备进一步用DEAE-纤维素柱层析纯化。

3.DEAE-纤维素柱层析纯化

通过上述方法获得的鸡卵类黏蛋白溶液仍含有少量的卵清清蛋白。由于二者的等电点不同，采用DEAE-纤维素离子交换层析可以将二者分开。

（1）DEAE-纤维素的处理称取10g DEAE-纤维素粉，置于250mL烧杯中，加入150mL0.5mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl溶液浸泡20min。然后用布氏漏斗抽滤。蒸馏水洗至pH8.0左右，抽干。再移至250mL烧杯中，加入150mL HCl溶液浸泡20min，转移到布氏漏斗内，抽滤，用蒸馏水洗至pH6.0左右，最后转移到烧杯内，用150mL0.02mol/L pH6.5磷酸盐缓冲液浸泡约15mim，经真空干燥器脱气后装柱。

（2）装柱选用15mm×200mm层析柱，垂直夹于铁架台上。将脱气后的DEAE-纤维素装入柱内（装柱操作同上）。用pH6.5磷酸盐缓冲液平衡，流出液在核酸蛋白质检测仪上绘出稳定的基线即可加样。

（3）吸附将经Sephadex G-25脱盐后的卵类黏蛋白粗提液上样吸附，调节流速15滴/min，待样品全部流入柱床后，再用pH6.5的磷酸盐缓冲液平衡，目的是洗去未被吸附的杂蛋白，直至基线稳定。

（4）改用含0.3mol/L NaCl-0.02mol/L pH6.5的磷酸盐缓冲液洗脱，收集出峰蛋白液体。如果在前面的提取过程中条件控制得适宜，提取的鸡卵类黏蛋白是较纯的，洗脱时可能不出现鸡卵清蛋白峰（第1峰）。柱层析图谱见图4-1。

图4-1 鸡卵类黏蛋白在D E AE—纤维素柱上的洗脱曲线

4.鸡卵类黏蛋白纯品的制备

（1）透析除盐将收集的鸡卵类黏蛋白装入透析袋内，用蒸馏水进行透析，隔一段时间换一次水，直至经1%AgNO₃溶液检查无氯离子为止。

（2）调pH量透析后鸡卵类黏蛋白样品体积，转移到烧杯内。吸取1mL透析液置小试管中（测定蛋白含量用），剩余溶液小心用1mol/L HCl调至pH4.0。

（3）丙酮沉淀加入3倍体积的预冷丙酮（若pH准确，此时应出现大量沉淀），用塑料薄膜封严，冰箱内静置4h或过夜。

（4）离心虹吸出部分上清液，将沉淀部分转移到离心管内，于3500r/min离心10min，弃去上清液，收集沉淀。

（5）干燥将盛有沉淀的离心管放入真空干燥器中干燥，即可得到透明胶状物的鸡卵类黏蛋白。保存好，以备鉴定其纯度用。

5.鸡卵类黏蛋白含量测定

将待测透析液样品稀释5～10倍，以蒸馏水作空白对照，测定A₂₈₀鸡卵类黏蛋白含量。

【结果处理】

1.根据公式计算鸡卵类黏蛋白总含量（mg）。

2.鸡卵类黏蛋白的产率（%）=100mL鸡蛋清得到鸡卵类黏性蛋白的毫克数。

3.绘制Sephadex G-25柱层析分离鸡卵类黏蛋白的层析图。

4.绘制DEAE-纤维素离子交换柱层析分离鸡卵类黏蛋白的层析图。

【要点提示】

1.在鸡卵类黏蛋白的制备过程中，最重要的环节是掌握好溶液的pH，这是实验成败的关键。鸡卵类黏蛋白在10% pH3.5的三氯乙酸溶液中有很好的溶解度，只有小量的（约5%）沉淀，而鸡卵清蛋白则会出现大量（约95%）的沉淀，因此，只要将提取液的pH严格控制在pH3.5，可以将鸡卵类黏蛋白和鸡卵清蛋白基本分开，而且鸡卵类黏蛋白的产率也比较高。

2.经10%三氯乙酸提取鸡卵类黏蛋白的上清液及DEAE-纤维素离子交换层析后的透析液都要用丙酮沉淀鸡卵类黏蛋白，在加丙酮之前，一定要先将溶液的pH精确调至所规定的范围，否则加入丙酮后不会出现沉淀或者只出现极少的沉淀，而且事后难以弥补。

3.消光系数的定义：芳香族氨基酸在280nm处有最大吸收峰。蛋白质分子中含有芳香族氨基酸的数量以及分子的紧密程度有差异，在280nm处的光吸收强弱不同。在一定条件下，一种纯的蛋白质在280nm处的光吸收值是一个常数。符号表示该蛋白质溶液在浓度为1%（质量浓度），光程为1cm条件下的吸光值。

【思考题】

1.在鸡卵黏蛋白的提取分离及纯化过程中，直接影响产率的是哪几步？应当注意什么？

2.简述分离纯化鸡卵黏蛋白主要应用了蛋白质的什么性质及哪些生化技术？

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