多糖的提取、纯化与鉴定方法详解

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：（一）多糖的提取、纯化了解多糖提取和纯化的一般方法。多糖的纯化，就是除去存在于粗多糖的杂质而获得单一的多糖组分。它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。各管用硫酸苯酚法检测多糖。本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的特征吸收峰，可以根据其特征吸收峰来鉴定糖类物质。

（一）多糖的提取、纯化

【目的要求】

了解多糖提取和纯化的一般方法。

【实验原理】

多糖类物质是除蛋白和核酸之外的又一类重要的生物分子。早在20世纪60年代，人们就发现多糖具有复杂的生物活性和功能。它可以调节免疫功能，促进蛋白质和核酸的生物合成，调节细胞的生长，提高生物活性和功能。它可以调节免疫功能，促进蛋白质和核酸的生物合成，调节细胞的生长，提高生物体的免疫力，具有抗肿瘤和抗艾滋病等功效。

由于高等真菌多糖主要是细胞壁多糖，多糖组分主要存在于小纤维网状结构交织的基质中，利用多糖溶于水而不溶于酶等有机溶剂的特点，通常采用热水浸提后用酒精沉淀的方法，对多糖进行提取。影响多糖提取率的因素很多，如浸提温度、时间、加水量以及脱杂的发法等，都会影响多糖的得率。

多糖的纯化，就是除去存在于粗多糖的杂质而获得单一的多糖组分。一般是先脱除非多糖组分，再对多糖组分进行分级。常用的除去多糖中蛋白质的方法有：Sevag法、三氟三氯乙烷法、三氯醋酸法，这些方法的原理是使多糖不沉淀而使蛋白质沉淀，其中Sevag方法脱蛋白质的方法效果较好，它是用氯仿∶戊醇或正丁醇，以4∶1比例混合，加到样品中使蛋白质变性成不溶状态，用离心方法除去。

本实验采用Sevag法（氯仿∶正丁醇=4∶1混合摇匀）进行脱蛋白质，用DEAE Sepharose层析柱进行纯化，然后合并多糖高峰部分，浓缩后透析、冻干，得多糖物质。

【试剂与器材】

1.试剂

平衡缓冲溶液：0.01mol/L Tris-HCl，pH为7.2。

洗脱液A：0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris-HCl，pH为7.2。

洗脱液B：0.1mol/L NaCl，0.01mol/L Tris-HCl，pH为7.2。

氯仿、正丁醇、乙醇（95%）等，均为分析纯。

2.材料

灰树花子实体。

3.器材

旋转真空蒸发仪；摇床；离心机；层析柱（26mm×10cm）；恒温振荡器。

【操作方法】

1.粗多糖的提取

将灰树花子实体切碎烘干后称量，采用热水浸泡提取法，每次原料和水比例均为1∶5，浸提湿度为70～80℃，浸提时间3～5h，共提取4次，合并4次浸提液。真空旋转蒸发浓缩，浓缩1倍体积。对多糖提取液需进行脱色处理，（以1%的比例加入活性炭，搅拌均匀15min后过滤）。在浓缩液中加入3倍体积的乙醇（95%）搅拌，沉淀为多糖和蛋白质的混合物，此为粗多糖。它只是一种多糖的混合物，其中可能存在中性多糖、酸性多糖、单糖、低聚糖、蛋白质和无机盐，必须进一步分离纯化。

2.粗多糖的纯化

粗多糖溶液加入Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1混合摇匀）后，置恒温振荡器中振荡过夜，使蛋白质充分沉淀，再用3000r/min离心分离，去除蛋白质。然后浓缩、透析，加入4倍体积的乙醇沉淀多糖，将沉淀冻干。

取样品0.1g溶于10mL平衡缓冲液中。上样用洗脱液A和洗脱液B进行线性洗脱，分部收集。各管用硫酸苯酚法检测多糖。合并多糖高峰部分，浓缩后透析、冻干，即得多糖。

（二）多糖的鉴定(www.chuimin.cn)

【目的要求】

（1）了解薄层层析法分析单糖组分的原理和方法。

（2）了解红外光谱法鉴定多糖的原理和方法。

【实验原理】

采用薄层层析法分析单糖组分。薄层层析显色后，比较多糖水解所得单糖斑点的颜色和R_f值与不同单糖标样参考斑点的颜色和R_f，确定样品多糖的单糖组分。

多糖的分析、鉴定一般借助于气相色谱（GC）、高效液相色谱（HPLC）、红外光谱（LR）和紫外光谱（UV）等技术，气相（液相）色谱-质谱（GC/HPLC-MS）联用技术成为分析多糖更为有效的手段。

本实验利用红外光谱对多糖进行鉴定。多糖类物质的官能团在红外谱图上表现为相应的特征吸收峰，可以根据其特征吸收峰来鉴定糖类物质。O—H的伸缩振动吸收峰在3650～3590cm^-1，C—H的伸缩振动吸收峰在2962～2853cm^-1，C═O的振动峰为1510～1670cm^-1之间的吸收峰，C—H的弯曲振动吸收峰为1485～1445cm^-1，吡喃环结构的C—O吸收峰为1090cm^-1。

【试剂与器材】

1.试剂

浓硫酸，氢氧化钡，硅胶，0.3mol/L磷酸二氢钠，多糖。

展开剂：正丁醇∶乙酸乙酯∶异丙醇∶醋酸∶水∶吡啶=7∶20∶12∶7∶6∶6。

显色剂：1，3-二羟基萘硫酸溶液（0.2%1，3-二巯基萘乙醇溶液）∶浓硫酸=1∶0.04（体积比）。

单糖标准品。

2.器材

不锈钢锅；电磁炉；玻璃板；傅里叶变换红外光谱仪。

【操作方法】

1.单糖组分分析

（1）薄层板制备称取硅胶5g，置于50mL烧杯中，加入12mL0.3mol/L磷酸二氢钠水浴，用玻璃棒慢慢搅拌至硅胶分散均匀，然后铺在玻璃板（7.5cm×10cm）上，110℃下活化1h，立即放入有干燥剂的干燥箱中备用。

（2）点样称取少许的多糖（0.1g）于2.0mL离心管中，加入1mol/L的硫酸1mL，沸水浴水解2h，然后加氢氧化钡中和至中性，过滤除去硫酸钡沉淀，得多糖水解澄清液。以此水解液和单糖标准品点样，进行薄层层析展开：用点样器点样于薄层板上，一般为圆点，点样基线距底边2.0cm，点样直径为2～3mm，点间距离为1.5～2.0cm，点间距离可视斑点扩散情况以及不影响检出为宜。点样时必须注意勿损伤薄层表面。

（3）展开展开时预先用展开剂饱和，将点好样品的薄层板放入展开室的展开剂中，浸入展开剂的深度为距薄层板底边0.5～1.0cm（切勿将样点浸入展开剂中），密封，等展开至规定距离（一般为10～15cm），取出薄层板，晾干。

（4）显色将展开晾干后的薄板再在100℃烘箱内烘烤30min，将显色剂均匀地喷洒在薄板上，此板在110℃下烘烤10min即可显色。

薄层显色后，将样品图谱与标准样图谱进行比较，参考斑点颜色、相对位置及R_f值，确定样品中有哪几种糖。

2.红外光谱在多糖分析上的应用

将冻干后的样品用KBr压片，在4000～400cm^-1区间内红外光谱扫描，有如下多糖特征吸收峰：3401cm^-1（O—H），2919cm^-1（C—H），1381cm^-1及1076cm^-1（C—O）。在900cm^-1处的吸收峰说明该多糖以β-糖苷键链接。在N—H变角振动区1650～1550cm^-1处有明显的蛋白质吸收峰，表明该样品是多糖蛋白质复合物。

多糖的提取、纯化与鉴定方法详解

相关推荐