氨基移换作用定性鉴定结果

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：转氨酶的种类甚多，任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，它们的最适pH接近7.4。本实验利用纸上层析法分离与鉴定动物肝脏中谷丙转氨酶催化丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸，证实肝脏组织中发生的氨基移换作用。

【目的要求】

1.学习一种鉴定氨基移换作用的简便方法及其原理。

2.进一步掌握纸层析的原理和操作技术。

3.了解氨基移换作用在中间代谢中的意义。

【实验原理】

氨基移换酶也称转氨酶。它能催化α-氨基酸的氨基与α-酮酸的α-酮基互换，这种作用称为氨基移换作用。转氨酶在生物体内蛋白质的合成与分解，糖、脂肪、蛋白质三类物质代谢的相互联系、相互转化中都起着很重要的作用。转氨酶的种类甚多，任何一种氨基酸进行转氨作用时，都由其专一的转氨酶催化，它们的最适pH接近7.4。在各种转氨酶中，以谷氨酸-丙酮酸转氨酶（简称GPT）及谷氨酸-草酰乙酸转氨酶（简称GOT）活力最强。催化反应如图3-16所示。

图3-16 转氨酶催化反应

上述两种酶均广泛存在于生物机体中，在正常人血清中也有少量存在。机体发生肝炎、心肌梗死等病变时，血清中转氨酶活力常显著增加，在临床上转氨酶活性的测定是诊断的重要参考指标。

本实验利用纸上层析法（层析原理见实验5）分离与鉴定动物肝脏中谷丙转氨酶（GPT）催化丙氨酸与α-酮戊二酸生成谷氨酸，证实肝脏组织中发生的氨基移换作用。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液0.2mol/L Na₂HPO₄溶液81mL与0.2mol/L NaH₂PO₄溶液19mL混匀，用蒸馏水稀释20倍。

（2）0.1mol/L丙氨酸溶液称取丙氨酸0.89g，先溶于少量0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/L NaOH仔细调至pH7.4，然后用磷酸缓冲液稀释至100mL。

（3）0.1mol/Lα-酮戊二酸溶液称取α-酮戊二酸1.461g，先溶于少量0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/L NaOH仔细调至pH7.4，再用磷酸缓冲液稀释至100mL。

（4）0.1mol/L谷氨酸溶液称取谷氨酸0.735g，先溶于少量0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液中，以1mol/L NaOH仔细调至pH7.4，再用磷酸缓冲液稀释至100mL。

（5）0.5%茚三酮-丙酮溶液称取茚三酮0.5g，溶于100mL丙酮中。

（6）80%苯酚溶液。

（7）新鲜动物肝脏。

2.器材

恒温水浴锅；尺子；铅笔；培养皿；表面皿；毛细管；组织匀浆器；喷雾器；吹风机；电炉；层析滤纸（新华1号）。

【操作方法】

1.肝匀浆制备(www.chuimin.cn)

取新鲜的动物肝脏1g，置组织匀浆器中，加入9mL冰冷的0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液，迅速研成匀浆。

2.氨基移换反应

（1）取干燥试管2支，分别标明测定管与对照管，各加入肝匀浆10滴。测定管放入37℃水浴保温10min，对照管放入沸水浴中煮沸10min。取出用流水冷却。

（2）于两管中各加入0.1mol/L丙氨酸0.5mL、0.1mol/Lα-酮戊二酸0.5mL和0.01mol/L pH7.4磷酸缓冲液1.5mL，摇匀，同置37℃水浴1h。取出，将测定管放入沸水浴中5min以终止反应，流水冷却。两管分别过滤到干燥小试管（标明“测定”“对照”）中，留待层析用。

3.纸上层析法鉴定

图3-17 层析滤纸图

（1）洗净手后，取直径12.5cm圆形滤纸一张，以滤纸中心为圆心，用圆规做半径为1cm的圆，通过圆心用铅笔做两条相互垂直的线，在底线上用铅笔等距离点4个点，标明1、2、3、4（图3-17）。取4根毛细管，分别在1、3处点测定管和对照管，2、4处点丙氨酸和谷氨酸。点子扩散直径控制在0.1～0.2cm内。点样时，必须待第1滴样品用冷风吹干后，再点第2滴，如此反复3～5次。

（2）在滤纸圆心处打一小孔（如铅笔芯大小），另取同类滤纸约1cm²，下一半剪成须状，卷成圆筒，如灯芯，插入小孔（勿使突出滤纸面）。

（3）将直径为5cm的表面皿置于培养皿正中，取苯酚层析溶剂4mL放入表面皿中。将滤纸平放在培养皿上，使灯芯浸入溶剂中，将另一相同直径培养皿反盖其上（图3-18）。层析中溶剂沿灯芯上升到滤纸，再向四周扩展。待溶剂前缘距滤纸边缘约1cm时，取出滤纸，用铅笔描出溶剂扩展边缘，滤纸用吹风机吹干或在60℃烘箱中烤干。

图3-18 纸层析装置

（4）将滤纸平放于培养皿上，用喷雾器喷上茚三酮-丙酮溶液，立即用吹风机热风吹干。这时在滤纸的不同位置上可见有紫红色的斑点出现，用铅笔描出斑点及溶剂前沿的边缘，米尺测量各斑点中心与原点的距离及原点与溶剂前沿的距离。

4.计算与结果

层析后，样品在图谱上的位置即在纸上的移动速度用R_f值表示：

计算各斑点的R_f值，判定测定管和对照管中分离得到的是何种氨基酸。

【要点提示】

1.手上的汗渍会污染滤纸，层析前必须先洗干净手或带上一次性手套再拿滤纸。

2.操作中层析用滤纸不要折叠，以免影响层析效果。

3.点样时，将滤纸放在一张洁净的纸上进行操作。尽量少用手接触滤纸，以免玷污。

【思考题】

比较各斑点的位置和颜色深浅，解释测定管和对照管的R_f值为什么不同？