脂肪酸β-氧化实验：生物化学实验指南

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：脂肪酸的β-氧化是脂类分解代谢的重要途径，在动物肝脏中进行。脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶A。乙酰乙酸β-羟丁酸和丙酮统称为酮体。表3-28 酮体的生成3.酮体的测定另取50mL锥形瓶2只并编号，按表3-29操作进行酮体的测定。

【目的要求】

1.理解脂肪酸的β-氧化作用。

2.了解测定丙酮含量的原理。

【实验原理】

脂肪酸的β-氧化是脂类分解代谢的重要途径，在动物肝脏中进行。脂肪酸经β-氧化作用生成乙酰辅酶A。2分子乙酰辅酶A可缩合生成乙酰乙酸，乙酰乙酸可经脱羧作用生成丙酮，也可以还原生成β-羟丁酸。乙酰乙酸β-羟丁酸和丙酮统称为酮体。

本实验用新鲜肝糜与丁酸保温，生成的丙酮可借碘仿反应来测定，即用过量的碘（定量）在碱性条件下与丙酮作用，生成碘仿，以标准硫代硫酸钠（Na₂S₂O₃）溶液在酸性环境中滴定剩余的碘，从而可计算出丙酮的生成量。反应式如下：

剩余的碘，可用标准Na₂S₂O₃溶液滴定。

由（1）、（2）、（3）、（4）的反应化学方程式可得出：

1CH₃COCH₃～3NaIO～3I₂～6Na₂S₂O₃

因此每消耗1mol的Na₂S₂O₃相当于生成了1/6mol的丙酮；根据滴定样品与滴定对照所消耗的Na₂S₂O₃溶液体积之差，可以计算出由丁酸氧化生成丙酮的量。

【试剂与器材】

1.试剂

（1）0.5%（质量浓度）淀粉溶液。

（2）0.9%（质量浓度）NaCl溶液。

（3）0.5mol/L丁酸溶液。

（4）15%（质量浓度）三氯乙酸溶液。

（5）10%（质量浓度）NaOH溶液。

（6）10%（体积分数）盐酸溶液。

（7）0.1mol/L I₂溶液称取碘12.7g和KI25g，溶于蒸馏水中，稀释到1000mL，混匀，用标准0.05mol/L Na₂S₂O₃溶液标定。

（8）标准0.01mol/L Na₂S₂O₃溶液（临用时将已标定的0.05mol/L Na₂S₂O₃溶液稀释成0.01mol/L）。

（9）1/15mol/L pH7.6磷酸缓冲液1/5mol/L Na₂HPO₄溶液86.8mL与1/15mol/L NaH₂PO₄溶液13.2mL混合。

2.器材(www.chuimin.cn)

恒温水浴锅；5mL微量滴定管；移液管；剪刀及镊子；组织匀浆器；50mL锥形瓶；漏斗；滤纸；家兔。

【操作方法】

1.肝糜制备

（1）将家兔颈部放血处死，取出肝脏；用0.9%NaCl溶液洗去污血；用滤纸吸去表面的水分。

（2）称取肝组织5g置研钵中，加少量0.9%NaCl溶液，研磨成细浆。再加0.9%NaCl溶液至总体积10mL，得肝组织糜。

2.酮体生成和沉淀蛋白质

取50mL锥形瓶2只，编号，并按表3-28操作提取酮体。

表3-28 酮体的生成

3.酮体的测定

另取50mL锥形瓶2只并编号，按表3-29操作进行酮体的测定。

混匀后立即用0.01mol/L标准Na₂S₂O₃溶液滴定剩余的碘，滴至浅黄色时，记录滴定1号瓶与2号瓶溶液所用Na₂S₂O₃溶液的毫升数，并按下式计算样品中的丙酮含量。

表3-29 酮体的测定

4.计算

肝脏的丙酮含量（mmol/g）=（V_对照-V_样品）×c ÷6

式中 V_对照——滴定对照所消耗的标准Na₂S₂O₃溶液的体积，mL；

V_样品——滴定样品所消耗的标准Na₂S₂O₃溶液的体积，mL；

c——标准Na₂S₂O₃溶液的浓度（mol/L）。

【要点提示】

1.所用材料必须新鲜，以保证肝脏细胞内酶的活性；肝组织要在冰浴中研磨成细浆。

2.在43℃恒温水浴内保温，其目的是在酶的作用下让丁酸充分反应；三氯乙酸的作用是使肝匀浆的蛋白质、酶变性，发生沉淀并终止反应。

3.为减少误差，应尽量缩短滴定样品瓶和对照瓶的时间间隔；滴定终点均为浅黄色，滴定结束后样品瓶和对照瓶中的溶液颜色应一致。