生物化学实验指导：高效碱性磷酸酶（AKP）分离纯化

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：碱性磷酸酶是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。碱性磷酸酶最适pH范围为8.6～10.0，主要存在于小肠黏膜、肾、骨骼、肝和胎盘等组织的细胞膜上。本实验采取有机溶剂分步沉淀法从兔肝或肾组织匀浆液中提取分离碱性磷酸酶。含有AKP的滤液再进一步用冷丙酮和冷乙醇进行分离纯化。碱性磷酸酶蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染色法。

【目的要求】

1.了解有机溶剂分步沉淀酶蛋白的原理和方法。

2.掌握测定碱性磷酸酶活力和比活力的方法。

【实验原理】

碱性磷酸酶（AKP）是一种底物特异性较低，在碱性环境中能水解多种磷酸单酯化合物的酶，需要镁和锰离子为激活剂。AKP具有磷酸基团转移活性，能将底物中的磷酸基团转移到另一个含有羟基的接受体上，如磷酸基团的接受体是水，则其作用就是水解。碱性磷酸酶最适pH范围为8.6～10.0，主要存在于小肠黏膜、肾、骨骼、肝和胎盘等组织的细胞膜上。

本实验采取有机溶剂分步沉淀法从兔肝或肾组织匀浆液中提取分离碱性磷酸酶。利用乙醇、丙酮、正丁醇等有机溶剂可以降低酶的溶解度，是通过降低介质的介电常数及其对酶蛋白的脱水作用达到目的。由于降低了溶液的介电常数，带有相反电荷的酶蛋白表面残基之间的吸引力增加，导致酶蛋白凝集而易从溶液中沉淀出来。此类有机溶剂也溶解于水，与水分子结合而导致蛋白质的脱水作用，进一步加强酶蛋白的沉淀析出。

在制备肝匀浆时，采用低浓度醋酸钠可以达到低渗破膜的作用，而醋酸镁有保护和稳定AKP的作用。匀浆液中加入正丁醇能使部分杂蛋白变性，可通过过滤而除去。含有AKP的滤液再进一步用冷丙酮和冷乙醇进行分离纯化。根据AKP溶解于终浓度33%的丙酮或终浓度30%的乙醇中，而不溶解于终浓度50%的丙酮或终浓度60%的乙醇中的性质，采用离心的方法重复分离提取，可使AKP得到部分纯化。

酶的比活力是指每单位质量（mg）酶制剂蛋白样品中含的酶活力单位。随着酶蛋白逐步被纯化，其比活力随之逐步升高，因此，比活力可以用来鉴定酶的纯化程度。

AKP活力测定采用磷酸苯二钠法。在一定的pH和温度条件下，待测液中的碱性磷酸酶作用于底物磷酸苯二钠，使之水解放出酚。酚在碱性溶液中，与4-氨基安替比林作用并经铁氰化钾氧化生成红色醌类化合物。根据红色深浅可以测定酶活力高低，从而计算出酶的活力单位。

碱性磷酸酶蛋白含量测定采用考马斯亮蓝染色法。考马斯亮蓝与蛋白着色，在一定浓度范围内蛋白质含量与颜色深浅成正比。根据测得的酶制剂蛋白毫克数及酶活力单位数计算比活力，可鉴定酶的纯化程度。

【试剂与器材】

1.试剂、材料

（1）0.5mol/L醋酸镁溶液称取醋酸镁（相对分子质量214.45）107.25g溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。

（2）0.1mol/L醋酸钠溶液称取醋酸钠（相对分子质量82.03）8.2g溶于蒸馏水中，稀释至1000mL。

（3）0.01mol/L醋酸镁-醋酸钠混合液取0.5mol/L醋酸镁20mL，0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。

（4）丙酮。

（5）95%乙醇。

（6）正丁醇。

（7）pH8.8Tris-醋酸镁缓冲液称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解并稀释至1000mL，即成0.1mol/L Tris溶液。取100mL0.1mol/L Tris溶液，加800mL蒸馏水、100mL0.1mol/L醋酸镁，混匀后用1%醋酸调pH至8.8，再用蒸馏水稀释至1000mL即可。

（8）复合底物液称取磷酸苯二钠6g、4-氨基安替比林3g，分别溶于煮沸并冷却后的蒸馏水中，两液混合并稀释至1000mL。加入4mL氯仿，贮存于棕色瓶内，置冰箱中保存。此液可用一周，使用时0.1mol/L pH10.0碳酸盐缓冲液等量混合即可。

（9）0.1mol/L pH10.0碳酸盐缓冲液称取Na₂CO₃6.36g及NaHCO₃3.36g溶于蒸馏水中，溶解后稀释至1000mL。

（10）0.5%铁氰化钾溶液称取铁氰化钾5g、硼酸15g，分别溶于400mL蒸馏水中。溶解后将两液混合，加蒸馏水至1000mL。置于棕色瓶中，暗处保存。

（11）酚标准液称取重结晶酚1.5g溶于0.1mol/L HCl中，并用此盐酸稀释至1000mL即成贮备液。取上述酚液25mL于250mL碘量瓶中，加50mL0.1mol/L NaOH并加热至65℃，再加入0.1mol/L碘液25mL，盖好瓶塞，放置30min后，加浓盐酸5mL，再以0.1%淀粉液作指示剂，用0.1mol/L标准Na₂S₂O₃滴定，滴定反应如下：

3I₂+C₆H₅OH—→C₆H₂I₃（OH）+3HI

I₂+2Na₂S₂O₃—→2NaI +Na₂S₄O₆

根据上述反应，3分子碘（相对分子质量254）与1分子酚（相对分子质量94）起作用，因此每毫升0.1mol/L碘溶液（含碘12.7mg）所相当的酚毫克数为₌1.567。假设0.1mol/L碘液25mL与25mL酚液作用后，剩余的碘用Na₂S₂O₃滴定为XmL，则25mL酚溶液中所含酚量为（25-X）×1.567，由此推算酚贮备液浓度。最后将贮备液稀释成0.1mg/mL应用液。

（12）标准蛋白溶液称取牛血清白蛋白100mg溶于9g/L NaCl溶液，稀释至100mL。

（13）考马斯亮蓝试剂称取考马斯亮蓝G-250100mg溶于50mL95%乙醇，加入100mL85%磷酸（质量浓度），用蒸馏水稀释至1000mL。

（14）新鲜兔肝或兔肾。

2.器材

可见分光光度计；低速离心机；吸量管（0.1mL，5mL，10mL）；试管及试管架；恒温水浴锅；玻璃组织匀浆器；烧杯（100mL，500mL）；刻度离心管。(www.chuimin.cn)

【操作方法】

1.碱性磷酸酶的分离纯化

（1）匀浆称取新鲜兔肝2g或兔肾1g，剪碎，置于玻璃组织匀浆器中，加入0.01mol/L醋酸镁-醋酸钠混合液6mL，匀浆3～4min。匀浆液倒入刻度离心管，记录体积。取0.1mL于另一试管中，加4.9mL pH8.8Tris-醋酸镁缓冲液稀释，作为A液，待测比活力用。

（2）提取加2mL正丁醇于匀浆液中，用玻棒充分搅拌2min，室温放置20min。纱布过滤，滤液置于刻度离心管中。

（3）丙酮沉淀滤液中加入等体积的冷丙酮，混匀，3000r/min离心5min。将上清液倒弃，在沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁4mL，用玻棒充分搅拌使其溶解，记录悬液体积。取0.1mL于另一试管中，加入pH8.8Tris醋酸镁缓冲液4.9mL，作为B液待测比活力用。

（4）分步分离于悬液中加入冷95%乙醇，使乙醇最终浓度达30%，混匀，2000r/min离心5min。将上清液倒入另一离心管中，弃沉淀。上清液中加入冷95%乙醇，使乙醇最终浓度达60%，混匀，3000r/min离心5min。弃上清液，沉淀中加入0.5mol/L醋酸镁3mL，充分混匀，记录体积。取0.1mL于另一试管中，加pH8.8Tris-醋酸镁缓冲液2.9mL，作为C液待测比活力用。

（5）其余悬液中加入冷丙酮，使丙酮最终浓度达33%，混匀，2000r/min离心5min。弃沉淀，上清液中加入冷丙酮，使丙酮最终浓度达50%，混匀，3000r/min离心5min。弃上清液，沉淀中加入pH8.8Tris-醋酸镁缓冲液5mL，混匀，2000r/min离心5min。上清液为部分纯化的酶液，作为D液用于比活力测定。

2.碱性磷酸酶的活力测定

（1）取6支试管，编号，按表3-22操作。

（2）加入复合底物液后，立即混匀，在37℃水浴中准确保温15min。保温结束后，各管加入0.5%铁氰化钾液2.0mL，立即混匀以终止酶促反应。静置显色15min，以空白管调零，于510nm波长处比色。

表3-22 碱性磷酸酶的活力测定

（3）酶活力计算规定在37℃下与底物作用15min产生1mg酚为1个酶活力单位。故每毫升酶液中的酶活力单位数为：

3.碱性磷酸酶蛋白质含量测定

（1）取6支试管，编号，按表3-23操作。

各管充分混匀，2min后以空白管调零，于595nm波长处比色。

（2）蛋白质含量计算。

表3-23 碱性磷酸酶蛋白质含量测定

4.比活力及得率的计算

（1）比活力计算：