测定枯草芽孢杆菌蛋白酶活力-生物化学实验指导

2023-11-06 理论教育版权反馈

【摘要】：学习福林-酚法测定蛋白酶活力的原理和操作方法。枯草芽孢杆菌蛋白酶粉。表3-21 酪氨酸标准曲线的绘制以不含酪氨酸的“0”号管为空白，分别测定各管吸光度。滤液根据酶活力再次用缓冲液稀释至适当浓度供测试用。

【目的要求】

学习福林-酚法测定蛋白酶活力的原理和操作方法。

【实验原理】

蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解底物酪蛋白产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等）。在碱性条件下，福林-酚试剂极不稳定，易被酚类化合物还原生成钼蓝与钨蓝，根据蓝色的深浅可以推断酶活力的大小。

本实验用一系列不同浓度的酪氨酸标准溶液分别与福林-酚试剂作用，生成蓝色深浅各不同的一系列溶液，用分光光度法测定680nm波长处吸光度，做出酪氨酸浓度-吸光度的标准曲线。然后用酶促水解液与福林-酚试剂进行显色反应，测定A₆₈₀，查阅标准曲线，即可求得酶活力。

【试剂与器材】

1.试剂、材料

（1）福林-酚试剂称钨酸钠（NaWO₄·2H₂O）100g、钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL、磷酸50mL和浓盐酸100mL。充分混匀，接回流冷凝管，小火回流10h。回流结束后加入硫酸锂（LiSO₄）150g、蒸馏水50mL及数滴液体溴，开口继续煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，需再重复滴加液体溴的步骤）。将溶液稀释至1000mL，过滤，置棕色瓶中保存。使用时用水1∶2稀释。

（2）0.4mol/L Na₂CO₃溶液称取无水碳酸钠42.4g，加水溶解，定容至1000mL。

（3）0.4mol/L三氯乙酸溶液称取三氯乙酸65.4g，加水溶解，定容至1000mL。

（4）pH7.5磷酸缓冲液称取磷酸氢二钠（Na₂HPO₄·12H₂O）6.02g、磷酸二氢钠（NaH₂PO₄·2H₂O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

（5）1%酪蛋白溶液称取酪蛋白1.00g，用少量0.5mol/L NaOH湿润后，加入缓冲液约80mL，在沸水浴中不断搅拌直至完全溶解。冷却后转入100mL容量瓶中，用缓冲液稀释至刻度。此溶液在冰箱内贮存，有效期为3d。

（6）100μg/mL酪氨酸标准液称取于105℃干燥至恒重的酪氨酸0.1000g，加入1mol/L HCl溶液60mL溶解，定容至100mL。吸取10mL，用0.1mol/L HCl定容至100mL，即为100μg/mL的使用液。

（7）枯草芽孢杆菌蛋白酶粉（AS1.398）。

2.器材

可见分光光度计；恒温水浴锅；电子天平；吸量管；旋涡混合器；试管及试管架；漏斗；滤纸；研钵；容量瓶。

【操作方法】

1.标准曲线的绘制

取6支试管，编号，分别按表3-21配置溶液。

表3-21 酪氨酸标准曲线的绘制(www.chuimin.cn)

以不含酪氨酸的“0”号管为空白，分别测定各管吸光度。以A₆₈₀为纵坐标，酪氨酸浓度（μg/mL）为横坐标，绘制标准曲线。根据作图或用回归方程，计算当吸光度为1时的酪氨酸的量（μg），即为吸光常数K，K值应在95～100范围内。

2.待测酶液的制备

称取蛋白酶粉1～2g，准确至0.001g（或吸取液体酶1mL），用少量缓冲液溶解，并用玻璃棒捣研。将上清液小心倾入容量瓶中，沉渣中再添加少量上述缓冲液，如此捣研3～4次，最后全部转入容量瓶中，用缓冲液定容至刻度，摇匀后用四层纱布过滤。滤液根据酶活力再次用缓冲液稀释至适当浓度（A₆₈₀在0.20～0.70范围内）供测试用。

3.蛋白酶活力测定

先将1%酪蛋白溶液放入37℃恒温水浴中预热5min，然后按下列程序操作：

4.计算

酶活力单位定义：在上述条件下，1min水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量为一个酶活力单位。以U/g表示：

式中 A——样品平行试验的平均吸光度；

K——吸光常数；

4——反应试剂的总体积，mL；

10——反应时间10min；

n——稀释倍数。

所得结果取整数表示。

【要点提示】

1.不同稀释倍数应做相应的空白试验。